Существует много протоколов для изоляции одиночных миофиберов от скелетных мышц взрослых мышей. Наш протокол разработан для очень молодых мышей и для маленьких мышей с очень хрупкими миофиберами. Эта стандартизированная процедура может быть использована для изучения миофибер-помощь мышечных стволовых клеток во время послеродового развития или в мышиных моделях заболеваний, которые делают миофиберы особенно восприимчивы к механическому стрессу.
Процедура будет продемонстрирована Глория Пеголи, аспирант, и Федерика Lucini, после докторской степени, как из лаборатории. Для вскрытия мышц и сбора урожая, используйте булавку, чтобы исправить одну заднюю конечность от усыпленной, очень молодой или очень маленькой мыши на вскрытии борту, и использовать острые пинцеты, чтобы поднять нижнее сухожилие голени передней до высоты лодыжки. Вырезать сухожилие и использовать тонкие ножницы, чтобы сократить все пути вокруг мышцы до сухожилия на уровне коленной чашечки.
Поместите мышцу в трубку раствора пищеварения и поднимите нижнее сухожилие дитенсорного дигорума longus, осторожно потянув вверх по сухожилию, чтобы отделить дитенсор digitorum longus от других мышц. Вырезать и урожай мышц. Поверните ногу, чтобы посмотреть мышцы спины и поднимите ахиллово сухожилие.
Мышцы гастрокнемиуса автоматически отделяются от других мышц. Вырезать верхнее сухожилие в задней части коленной чашечки и поместить мышцы в раствор пищеварения. Поднимите внешнее сухожилие ноги и сверните пинцет под сухожилие, чтобы аккуратно отделить сухожилие от мышцы.
Затем, вырезать для сбора мышц и собирать те же мышцы от другой ноги таким же образом. Когда все мышцы были собраны, поместите трубку сбора в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 45 до 50 минут и энергично инвертировать трубку 10 раз каждые 10 минут. Когда мышцы начинают ослабевать и миофиберы становятся видимыми, встряхните образцы в последний раз, прежде чем тщательно переносить подвеску пищеварения в предварительно разогретую или сыворотку с покрытием 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую 10 миллилитров стирального раствора.
Чтобы изолировать одиночные миофиберы, поместите блюдо под рассеченный микроскоп и используйте конную сыворотку, покрытую 200-микролитровым наконечником пипетки, чтобы разобрать отдельные мышечные волокна. Перенесите жизнеспособные миофиберы в конную сыворотку с покрытием 35-миллиметровой чашки Петри, содержащей пять миллилитров предварительно разогретого раствора для мытья. Когда все жизнеспособные миофиберы были собраны, уравночные образцы миофибера в инкубаторе клеточной культуры в течение пяти минут.
Если требуется больше миофиберов, используйте большую стеклянную пипетку, чтобы тритурировать оставшийся образец мышечной ткани до тех пор, пока не будут механически выпущены дополнительные волокна. Когда будет собрано достаточно миофиберов, поместите блюдо в инкубатор клеточной культуры на один час в течение дополнительного периода эквилибрации. В конце инкубации перенесите отдельные миофиберы на новое, предварительно подогретое конское блюдо с покрытием, содержащее соответствующую культурную среду, и верните тарелку в инкубатор клеточной культуры.
Для иммунофлуоресцентного анализа миофиберов, после перекрестного соединения, удалите все, кроме достаточного супернатанта, чтобы не удалять волокна и добавьте в ту же трубку один миллилитр 0,5%Triton X-100 в PBS для пятиминутной инкубации с нежным возбуждением. В конце инкубации, позвольте волокнам поселиться в течение пяти минут, прежде чем заменить супернатант с 1,5 миллилитров PBS. После пяти минут нежного возбуждения, дайте волокнам осесть еще на пять минут, прежде чем заменить супернатант на один миллилитр блокирующего раствора.
После одного часа нежного возбуждения замените блокирующий раствор свежим блокирующим раствором, содержащим первичные антитела, представляющие интерес для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия с нежным возбуждением. На следующее утро, мыть волокна с тремя пятиминутные моет в один миллилитр свежих 0,25%Tween 20 в PBS с использованием нежного возбуждения и пять минут осадков при комнатной температуре для мытья. После последней стирки, этикетка волокон с соответствующим флюорохромом конъюгированных вторичных антител, разбавленных в блокирующий раствор в течение одного часа при комнатной температуре с нежным возбуждением, защищены от света, а затем три моет в PBS плюс 0,1%Tween, защищены от света, как попродемонстрировано.
После последней стирки замените супернатант одним миллилитром раствора DAPI на пятиминутную инкубацию при комнатной температуре с нежным возбуждением, защищенным от света. В конце инкубации, мыть волокна и использовать блокирующий раствор покрытием пипетки с разрезом наконечником для сбора волокон и тщательно распространять волокна на стеклянной горке. Поместите слайд под рассечение микроскопа, и, используя только естественный свет, отраженный зеркалом, используйте новый 200 микролитровый наконечник пипетки, чтобы аккуратно распределить волокна и удалить избыток раствора.
После удаления избыточного раствора, дайте слайду высохнуть в темноте в течение 10-15 минут, пока не останется очень небольшой объем раствора. Затем добавьте соответствующий объем монтажной среды на волокна, прежде чем тщательно разместить крышку скольжения по тканям. Чтобы получить достаточное количество длинных, жизнеспособных волокон, которые могут выжить 96 часов в фактор роста богатой среде, четыре различных мышц, как правило, собирают и переваривают.
Только самые нетронутые волокна должны быть переданы в культурную среду. Разбитые волокна и другие обломки должны быть выброшены. После 72 часов культуры активированные спутниковые клетки генерируют агрегаты клеток, связанные с миофибером.
Мы наблюдаем, что культура клеток, полученных из дельты Ламин восемь 11 двойных отрицательных мышей образуются меньшим количеством клеток. После 96 часов, спутниковые клетки выражают MyoG, становятся видимыми в клеточном кластере, инициируя дифференциацию к новым миофиберам. Примечательно, что задержка динамики дифференциации спутниковых клеток наблюдается у гомозиготных мышей-мутантов Ламина по сравнению с их коллегами дикого типа.
Будьте уверены, чтобы практиковать шаги вскрытия мышц, как быстрый и точный урожай мышц имеет важное значение для успеха эксперимента. Этот метод позволяет отслеживать одиночные спутниковые клетки во время активации и дифференциации, облегчая изучение ключевых процессов, лежащих в основе роста и регенерации мышц в различных физиологических и патологических условиях.
