Esistono molti protocolli per isolare singole miofibre dai muscoli scheletrici dei topi adulti. Il nostro protocollo è ideato per topi molto giovani e per piccoli topi con una miofibra molto fragile. Questa procedura standardizzata può essere utilizzata per lo studio delle cellule staminali muscolari assistite da miofibra durante lo sviluppo postnatale o nei modelli di topi di malattie che rendono le miofibre particolarmente suscettibili allo stress meccanico.
La procedura sarà dimostrata da Gloria Pegoli, dottoranda, e Federica Lucini, post-dottorato, entrambe provenienti da un laboratorio. Per la dissezione muscolare e la raccolta, utilizzare un perno per fissare un arto posteriore da un topo eutanasiato, molto giovane o molto piccolo su una sezionante e utilizzare pinzette affilate per sollevare il tendine inferiore della tibialis anteriore all'altezza della caviglia. Tagliare il tendine e utilizzare forbici fini per tagliare tutto il muscolo al tendine a livello della rotula.
Posizionare il muscolo in un tubo di soluzione di digestione e sollevare il tendine inferiore del digitorum longus estensore, tirando delicatamente verso l'alto sul tendine per separare il digitorum longus estensore dagli altri muscoli. Tagliare e raccogliere il muscolo. Ruotare la gamba per visualizzare i muscoli della schiena e sollevare il tendine d'Achille.
Un muscolo gastrocnomio si separerà automaticamente dagli altri muscoli. Tagliare il tendine superiore nella parte posteriore della rotula e posizionare il muscolo nella soluzione di digestione. Sollevare il tendine esterno della gamba e arrotolare le pinzette sotto il tendine per separare delicatamente il tendine dal muscolo.
Quindi, taglia per raccogliere il muscolo e raccogliere gli stessi muscoli dall'altra gamba allo stesso modo. Una volta raccolti tutti i muscoli, posizionare il tubo di raccolta in un bagno d'acqua di 37 gradi celsius per 45-50 minuti e invertire vigorosamente il tubo 10 volte ogni 10 minuti. Quando i muscoli iniziano ad allentarsi e le miofibre diventano visibili, agitare i campioni un'ultima volta prima di trasferire attentamente la sospensione di digestione in una piastra di Petri pre-riscaldata o rivestita di siero di 100 millimetri contenente 10 millilitri di soluzione di lavaggio.
Per isolare singole miofibre, posizionare il piatto al microscopio di sezionamento e utilizzare una punta di pipetta da 200 microlitri rivestita di siero di cavallo per raccogliere le singole fibre muscolari. Trasferire le miefibre vitali in una piastra di Petri rivestita di siero di cavallo di 35 millimetri contenente cinque millilitri di soluzione di lavaggio prerimpinata. Una volta raccolte tutte le miofibre vitali, equilibrare i campioni di miofibra nell'incubatore di coltura cellulare per cinque minuti.
Se sono necessarie più miofibre, utilizzare una pipetta di vetro di grandi dimensioni per triturare il campione di tessuto muscolare rimanente fino a quando non vengono rilasciate meccanicamente fibre aggiuntive. Quando sono state raccolte abbastanza miofibre, posizionare il piatto nell'incubatore di coltura cellulare per un'ora per un ulteriore periodo di equilibrazione. Al termine dell'incubazione, trasferire le singole miofibre in un nuovo piatto rivestito di siero di cavallo preri riscaldato contenente il mezzo di coltura appropriato e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare.
Per un'analisi immunofluorescente delle miofibre, dopo il cross linking, rimuovere tutto ma abbastanza supernatante, per non rimuovere alcuna fibra e aggiungere allo stesso tubo un millilitro dello 0,5%Triton X-100 in PBS per un'incubazione di cinque minuti con delicata agitazione. Al termine dell'incubazione, lasciare depositare le fibre per cinque minuti prima di sostituire il supernatante con 1,5 millilitri di PBS. Dopo cinque minuti di delicata agitazione, lasciare depositare le fibre per altri cinque minuti prima di sostituire il supernatante con un millilitro di soluzione bloccante.
Dopo un'ora di delicata agitazione, sostituire la soluzione di blocco con una nuova soluzione di blocco contenente anticorpi primari di interesse per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius con delicata agitazione. La mattina seguente, lavare le fibre con tre lavaggi di cinque minuti in un millilitro di fresco 0,25%Tween 20 in PBS utilizzando agitazione delicata e cinque minuti di sedimentazione a temperatura ambiente per il lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le fibre con gli anticorpi secondari coniugati al fluorocromo appropriati diluiti in soluzione di blocco per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata, protetti dalla luce, seguiti da tre lavaggi in PBS più 0,1%Tween, protetti dalla luce, come dimostrato.
Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il supernatante con un millilitro di soluzione DAPI per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente con delicata agitazione, protetta dalla luce. Alla fine dell'incubazione, lavare le fibre e utilizzare una pipetta rivestita con soluzione di blocco con una punta tagliata per raccogliere le fibre e stendere accuratamente le fibre su uno scivolo di vetro. Posizionare lo scivolo sotto un microscopio sezionante e, utilizzando solo la luce naturale riflessa dallo specchio, utilizzare una nuova punta di pipetta da 200 microliter per stendere delicatamente le fibre e rimuovere la soluzione in eccesso.
Dopo aver rimosso la soluzione in eccesso, lasciare asciugare lo scivolo al buio per 10-15 minuti fino a quando rimane solo un volume molto piccolo di soluzione. Quindi, aggiungere un volume appropriato di mezzo di montaggio sulle fibre prima di posizionare attentamente un coperchio scivolare sui tessuti. Per recuperare un numero sufficiente di fibre lunghe e vitali che possono sopravvivere per 96 ore nel mezzo ricco di fattore di crescita, quattro muscoli diversi vengono in genere raccolti e digeriti.
Solo le fibre più intatte dovrebbero essere trasferite al mezzo di coltura. Le fibre rotte e altri detriti devono essere scartati. Dopo 72 ore di coltura, le cellule satellitari attivate generano aggregati cellulari legati alla miofibra.
Osserviamo che la coltura cellulare deriva dal delta del Lamin otto 11 topi doppio negativi sono formati da un numero minore di cellule. Dopo 96 ore, le cellule satellitari esprimono MyoG, diventano visibili all'interno dell'ammasso cellulare, iniziando la differenziazione verso nuove miofibre. In particolare, una dinamica ritardata della differenziazione cellulare satellitare è osservata nei topi knockout Lamin mutanti omozigoti rispetto alle loro controparti di tipo selvaggio.
Assicurati di praticare i passaggi di dissezione muscolare poiché un raccolto muscolare rapido e preciso è essenziale per il successo dell'esperimento. Questa tecnica consente il tracciamento di singole cellule satellitari durante l'attivazione e la differenziazione, facilitando lo studio dei processi chiave alla base della crescita e rigenerazione muscolare in diverse condizioni fisiologiche e patologiche.
