В этой частице мы вводим платформу экстракорпорального восстановления, которая имитирует липидную среду внутренней мембраны митохондрий. Эта платформа может быть использована для исследования молекулярных механизмов синтеза внутренней мембраны митохондрий. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет количественное исследование интегральных мембранных белков и мембранных белков в близкой родной среде.
Для начала смешайте растворы A и B в соответствии с рукописными направлениями, затем генерируйте липидную смесь, добавляя рассчитанный объем раствора хранения в янтарные флаконы со стеклянным шприцем. Матч окончательный объем, добавив дополнительный хлороформ во флаконы. Выпекать микроскоп coverglass слайды при температуре 520 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
После выпечки, охладить их до комнатной температуры. Добавьте около 10 граммов гидроксида натрия в 500 миллилитров метанола при перемешивании. Перемешать в течение двух часов, продолжая добавлять гидроксид натрия в раствор до тех пор, пока осадки начинают показывать.
Очистите стеклянные горки в растворе додецил сульфата натрия, метанол, насыщенный гидроксидом натрия, и 50 миллимоляреловую соляную кислоту, последовательно ванну sonicating слайды под каждым условием в течение 30 минут. Очистите стеклянные горки в ультрапурной воде в течение 10 минут между каждым условием. Храните очищенное стекло крышки, запечатанное раствором соляной кислоты в течение двух недель, чтобы обеспечить хорошее двухслойное качество.
Очистите политетрафторэтилен корыта системы погружения Лангмуир-Блоджетт с использованием хлороформа и ультрапурной воды до тех пор, пока не будет наблюдаться смачивание. Спрей хлороформа на поверхности корыта и протрите его тщательно три раза с целлюлозой салфетки, затем промыть его три раза с ультрачистой водой и удалить воду через всасывания. После завершения, покрыть поверхность корыта с чистой ультрачистой водой.
Возьмите два куска поверхности обработанные стекловолокна из раствора для очистки и промыть их ультрапурной водой в течение примерно 30 секунд. Поместите стекло крышки в спину к спине образом с помощью субстратного зажима для проведения стеклянных слайдов. Погрузите стеклянную горку под поверхностью воды, вручную нажав на ковш вниз по системе управления Langmuir.
Нулевой баланс пленки и тщательное распространение раствора B капля за каплей на воздушном водном интерфейсе. Убедитесь, что липиды распространяются только на воздушном водном интерфейсе без хлороформных и липидных капель, опускаясь на дно политратравтороэтиленовой поверхности, что создаст липидный канал и предотвратит образование монослой. Прекратите добавлять липиды, когда считывание баланса пленки составляет от 15 до 20 миллиньютон на метр.
Подождите от 10 до 15 минут, а затем инициировать барьер контроллер изменить площадь поверхности, нажав начать эксперимент. Подождите, пока считывание баланса пленки увеличится до 37 миллиньютон на метр и держать давление в течение примерно 20 до 30 минут. Поднимите стекло крышки со скоростью 22 миллиметра в минуту, сохраняя при этом поверхностное натяжение на уровне 37 миллиньютон на метр.
Липидный монослой с полимерной привязкой будет перенесен из интерфейса воздушной воды на поверхность крышки через процесс погружения Blodgett, образуя нижнюю листовку липидного двухслоя. Очистите интерфейс воздушной воды путем всасывания и промыть корыто с ультрачистой водой. После очистки одноуходного стеклянного слайда с хлороформом, этанолом и ультрапурной водой установите ее на корыто под слоем воды.
Убедитесь, что колодец обращен к интерфейсу воздушной воды и залить свежей ультрапурной водой до тех пор, пока стеклянная горка не будет полностью покрыта, затем погрузите стеклянную горку под поверхность воды, как описано ранее. Держите стекло крышки с липидным монослой с помощью кремниевой присоски и осторожно нажмите липидный монослой к интерфейсу воздушной воды. Держите крышку стекла в течение двух-трех секунд на интерфейсе, а затем нажмите его на слайд.
Возьмите слайд с крышкой. Возьмите стекло для крышки и двухслойный к микроскопу эпифторесценции и изображение липидного двухслоя в соответствии с текстовыми рукописными направлениями. Приготовьте хрустальную тарелку, содержащую ультрапурную воду, и поместите под блюдо чистое кольцо с изображением микроскопа.
Погрузите этот слайд и стекло, которые содержат липидный двухслой под водой. Аккуратно разделите слайд и стекло для крышки, удерживая слайд из стеклоокрывательного стекла снизу и перенесите стекло крышки в кольцо изображения. Замените ультрапурную воду в кольце изображения буфером хлорида натрия bis-tris, убедившись, что липидный бислой не подвергается воздействию пузырьков воздуха.
Добавьте 1,1 наномолярного n-октил-бета-глюкопираноида в липидный двухслойный слой, а затем немедленно добавьте смесь 1,2 наномолярного DDM и 1,3 пикомолов очищенных L-OPA1 в кольцо изображения. Инкубировать образец на скамейке верхней шейкер на низкой скорости в течение двух часов. Распределите 30 миллиграммов смолы SM-2 шарики на три миллилитров буфера бис-три и встряхните.
Используйте пластиковую пипетку, чтобы добавить от 5 до 10 микролитров смолы бусы SM-2 к изображению кольцо и инкубировать его в течение 10 минут, а затем промыть смолы шарики. Окончательный объем буфера в кольце изображения должен быть 1,5 миллилитров. Приготовьте один миллиграмм липидной смеси А в растворе хлороформа, затем испарите хлороформ под потоком азота в течение 20 минут.
Держите смесь под вакуумом на ночь, чтобы сформировать липидную пленку. Приготовьте 50 миллимолярный кальций, содержащий буфер, растворив 15,56 грамма кальцеина в 50 миллилитров 1,5 молярного гидроксида раствора. Перемешать смесь при комнатной температуре до полного растворения кальцина.
Добавьте 12,5 миллимолярные бис-три и ультрапурную воду для конечного объема в 500 миллилитров и отрегулируйте рН до 7,5. Обойти липидную пленку в кальциине, содержащем буфер, затем полностью увлажнить липид, нагревая подвеску при 65 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Форма 200 нанометровых липосом через экструзию с поликарбонатной мембраной.
Добавьте два микрограмма L-OPA1 в 0,5 микромолярном DDM, 2,2 миллиграмма липосомы и инкубировать раствор при четырех градусах по Цельсию в течение 1,5 часов. Удалите сурфактант путем диализа с помощью кассеты с 3,5 килодалтонным диализом против 250 миллилитров 25 миллимолярные бис-три, 150 миллимолярный хлорид натрия и 50 миллимолярный буфер кальция при четырех градусах Цельсия за одну ночь, изменив буфер дважды. Удалите дополнительный кальцеин с помощью столбца для дезавуирования PD10, а затем приступайте к анализу изображений и данных, описанным в текстовой рукописи.
Здесь показаны изображения микроскопии эпифлюоресценции бислоя липидов и его липидной текучести. Распределение липидов показано до и после отбеливания фотографий, а однородность показана до и после восстановления. L-OPA1 восстановлен и липидный двухслойный был подтвержден спектроскопией корреляции флуоресценции или FCS.
Кривые FCS показали, что 75% L-OPA1 был восстановлен в липидный двухслойный, предполагая, что L-OPA1 свободно рассеивается в полимерном привязанном липидовом двухслойном с потенциалом для самостоятельной сборки в функциональные комплексы. Отбеливание шага флуоресценции показало, что в среднем две-три копии L-OPA1 были восстановлены в данной липосоме. Распределение размеров восстановленных протеолипосом L-OPA1 было протестировано после восстановления с использованием DLS и проверено FCS.
Мембранное привязывание отслеживалось путем наблюдения сигнала Texas Red на поверхности липидного двухслоя с помощью микроскопии TIRF. Мембрана липидного де-смешивания или гемифузии контролируется через Texas Red, как липосомный маркер распространяется в липидный бислой. Кальцеин де-закалки помогли отличить полное образование пор синтеза только липидного де-смешивания, что позволяет сравнение между условиями, когда частицы стойло на гемифузии и частиц, которые приступить к полному слиянию.
Мембрана привязывания была показана стабильный липидный сигнал от липосом и выпот сигнала признакам не де-утоления в кальцин сигнала, но быстрый распад Техас Красный сигнал указал диффузии красителя в липидный двухслойный. Полное слияние признакам как липидного распада и содержания релиз. При попытке этой частицы, не забудьте тщательно очистить как стекло для покрытия и Langmuir корыта для обеспечения двух слоев высокого качества изготовлены.
Хорошее качество воздуха также имеет решающее значение для предотвращения дефектов в двухслойном. Этот метод прокладывает нам путь к изучению новых вопросов в динамике и организации мембран митохондрий. Захватывающий будущий эксперимент включает изучение влияния двухслойной ассиметрии, мембранного потенциала и связанных с болезнями мутантов в динамике внутренней мембраны митохондрий.
