Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы описать процедуры, связанные с созданием симптоматической, фармакологической модели мыши для дистонии DYT/PARK-ATP1A3 с помощью канюлей мозга в осмотических насосах и вызывая стресс через сложные двигательные задачи. Этот метод подробно, как установить фармакологическую модель мыши с использованием хронической доставки наркотиков с помощью осмотических насосов для нескольких канюли мозга и как вызвать фенотип через сложные двигательные задачи. Мягкая парадигма моторного стресса также дает представление о роли генно-экологических взаимодействий в двигательных расстройствах и может быть применена к другим моделям грызунов.
Эксперименты на животных проводились в соответствии с применимыми национальными и институциональными руководящими принципами по уходу и использованию животных. Начните с подготовки осмотических насосов в стерильной среде. Во-первых, заполните один миллилитр шприц с 27 калибровочных заполнения канюли со стерильным фильтрованным ouabain-решение или раствор транспортного средства.
Держите осмотический насос в вертикальном положении, вставьте канюлю полностью в насос и медленно заполняй резервуар до тех пор, пока сверху не появится избыток раствора. Затем вставьте модератор потока в насос. Аккуратно смахните белый фланг модератора потока ножницами и подключите кусок виниловых труб к модератору потока.
Погрузим каждый насос в трубы Эппендорфа, заполненные на полпути солевым раствором, и поместите их в термоциклер на 37 градусов, чтобы скорость перекачки достигла стабильного состояния перед началом операции. После того, как животное глубоко обезболилось в соответствии с утвержденными протоколами, поместите животное в стереотаксическую рамку и зафиксните голову резиновыми наконечниками или неразороткими ушными прутьями. После тщательной дезинфекции хирургической области, используйте скальпель, чтобы поместить разрез в верхней части головы и использовать ножницы, чтобы продолжить разрез до конечностей.
Выставить череп с помощью бульдога зажимы и протрите периостеум с стерильным хлопчатобумажным аппликатором. Выровнять либо ручку или кончик канюрной окрашены черными чернилами с bregma и использовать соответствующие координаты, чтобы отметить три точки входа для мозга канюли на черепе. Далее тщательно просверлите отверстия для двойного канюляра, предназначенного для базальных ганглиев и одной канюли, предназначенной для мозжечка.
Просверлите четвертое отверстие для небольшого винта между стриатумом и мозжечок. Этот винт в конечном итоге будет встроен в зубной цемент и обеспечить дополнительное удержание для канюли. Для того, чтобы создать небольшой карман для осмотического насоса с каждой стороны спины животных, используйте ткани force, чтобы отделить слои подкожной ткани.
Заранее типсы к одной задней ноге и открыть миппы немного для того, чтобы расширить подкожный карман. Повторите ту же процедуру для другой стороны, сначала удалив типсы из разреза, а затем толкая их осторожно к второй задней ноге. С помощью типсов тщательно вставьте насосы и подключенный катетер в каждый подкожный карман.
Карман должен позволить насосу легко скользить дюйма Используя держатель мини-насоса, ввемите одну осмотическую канюлю с пользовательской длиной 3,0 миллиметра в отверстие, просверленное в средней линии мозжечка. Отсоедините голову канюли тщательно и исправить канюлю, а также небольшой винт с зубным цементом, заботясь, чтобы не покрыть соединительный кусок для трубки осмотического насоса.
Убедитесь, что стоматолог цемента, окружающего канюлю полностью высохли, прежде чем продолжить операцию. Перед вставкой двойной канюли в двусторонние пробуренные отверстия над базальными ганглиями прикрепите два 0,5-сантиметровых куска виниловых труб к двум соединительным частям двойной канюли. Соедините виниловые трубки с адаптером бифуркации и тщательно заполните всю трубную систему стерильным раствором уабаина или транспортным средством.
Затем повторите те же шаги, что и ранее для одной канюле, и завершите, зафиксировав двойную канюлю зубным цементом. Подключите катетеры осмотических насосов к адаптеру бифуркации, а также к одной канюле соответственно. Оба насоса имеют равную скорость потока, поэтому будьте осторожны, чтобы соединить осмотический насос с двойным концентрированным раствором к адаптеру бифуркации, чтобы гарантировать, что та же концентрация достигает как базальных ганглиев, так и мозжечка.
Закройте разрез на спине животных швами, насколько это возможно, не перенапряжение кожи. Подкожно вводят стерильный солевой раствор, который должен иметь температуру тела, чтобы избежать обезвоживания. Удалите животное из стереотаксической рамы и поместите его в клетку восстановления.
Для того, чтобы вызвать дистонию, как движения, уабаин проникнуты мышей должны подвергаться сложным задачам двигателя, как мягкий стресс парадигмы через четыре часа после операции и повторяется каждые 24 часа после этого. Это не включает в себя поведенческую характеристику животных. Мы демонстрируем здесь пример транспортного средства проникнуты животных, который помещается на 50 сантиметров грубой поверхности деревянный столб, нос лицом вниз.
Обеспечить достаточно постельных принадлежностей у основания полюса в случае падения. Для уабаин проникнуты мышей, животные должны начать представлять первые симптомы, как bradykinesia четыре часа после операции. Тем не менее, через 24 часа после операции, вы должны увидеть непроизвольное гиперэкстензии передних или задних конечностей, как признак дистонии, как движения во время спуска.
Мыши должны спуститься полюс три раза, позволяют по крайней мере две минуты восстановления между каждым спуском. Время спуска не нужно измерять. Полюс тест должен сопровождаться второй задачей двигателя, используя вращающийся стержень.
Как сделано для теста производительности Rotarod, ouabain и транспортного средства проникнуты мышей из стрессовых групп помещаются на вращающийся стержень. Задержка падения не нуждается в измерении. Как и в предыдущем тесте, мышей следует поместить на вращающийся стержень три раза, что позволяет две минуты восстановления между пробегами.
Модифицированная шкала рейтинга дистонии может быть использована для оценки частоты, тяжести и распределения тела дистонии, как движения мышей. Зверей следует поместить в пластиковую или деревянную коробку, а движения следует фиксировать в течение четырех минут. Тариферы должны быть ослеплены групповым заданием.
Движения или позы, которые считаются дистонией, как являются непроизвольные гиперэкстензии передних конечностей, широкая позиция, или гиперэкстензия задних конечностей, а также кифоз. Если только одна часть тела влияет, дистония должна рассматриваться в качестве координационного. Если ствол и по крайней мере две другие части тела страдают, дистония должна рассматриваться как обобщенные.
Вторая недавно разработанная система скоринга от нуля до восьми баллов, оценивает наличие и тяжесть дистонии, как движения во время теста подвески хвоста. Для теста держите мышь за хвост возле ее основания в течение двух минут. Рекомендуется записать тест подвески хвоста и назначить балл для последующего анализа отснятого материала.
Передние конечности набрали от нуля до четырех очков. Повторные или устойчивые опровержения тонизирующего средства одной из передних конечностей, а также гиперэкстензия в сочетании с пересечением передних конечностей забиваются как дистония. Дистония-как движения задних конечностей, что означает опровержение и сжимая, а также устойчивый гиперэкстензии, забиваются от нуля до трех очков.
Truncal искажения настоящее более 80% от записанного времени забил с дополнительным пунктом. Задние конечности обхватив является неспецифическим признаком для двигательных нарушений и не должны быть забиты. На этом графике показаны результаты рейтинговой шкалы дистонии.
Уабаин проникнуты подчеркнул мышей настоящее время значительно больше дистонии, как движения в течение наблюдательного периода 72 часов, чем не-стресс уабаин проникнуты группы, а также животных транспортного средства. Это изображение изображает результаты теста подвески хвоста и показывает аналогичный результат по шкале рейтинга дистонии. Обратите внимание, что результаты среднего от общего балла каждого животного за каждый момент времени.
После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как стереотаксис имплантировать несколько канюли мозга и как подкожно имплантировать осмотические насосы. Основным преимуществом этого метода является то, что повторяющиеся и стрессовые инъекции можно избежать, и что субстрат, как уабаин, который в противном случае будет иметь системные побочные эффекты могут быть непосредственно доставлены в конкретные структуры мозга.
