Bu protokolün genel amacı, ozmotik pompalarda beyin kanülleri kullanarak ve zorlu motor görevleri ile stresin indükleyerek DYT/PARK-ATP1A3 distonisi için semptomatik, farmakolojik fare modelinin oluşturulmasında yer alan prosedürleri tanımlamaktır. Bu yöntem, birden fazla beyin kanüllerine ozmotik pompalar aracılığıyla kronik ilaç teslimatı kullanarak bir farmakolojik fare modelinin nasıl oluşturulabileceğini ve zorlu motor görevler aracılığıyla fenotipin nasıl indüklenebildiğini ayrıntılarıyla anlatır. Hafif motor stres paradigması aynı zamanda hareket bozukluklarında gen-çevresel etkileşimlerin rolüne dair içgörüler sağlar ve diğer kemirgen modellerine uygulanabilir.
Hayvan deneyleri, hayvanların bakımı ve kullanımı için geçerli ulusal ve kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Steril bir ortamda ozmotik pompalar hazırlayarak başlayın. İlk olarak, steril filtreli ouabain çözeltisi veya araç çözeltisi ile 27 gauge dolum kanül ile bir mililitreşşile şırınga doldurun.
Ozmotik pompayı dik konumda tutun, kanülleri pompaya kadar takın ve fazla çözelti üste çıkana kadar rezervuarı yavaşça doldurun. Daha sonra, akış moderatörü pompaya takın. Dikkatle makas ile akış moderatör beyaz flanş çıkarmak ve akış moderatör vinil boru bir parça bağlayın.
Her pompayı tuzlu çözeltiyle yarı yolda dolu Eppendorf tüplere batırın ve pompalama hızının ameliyata başlamadan önce sabit bir duruma ulaşmasını sağlamak için 37 derecelik bir termocycler'a koyun. Hayvan onaylanan protokollere göre derinden anestezi edildikten sonra, hayvanı stereotaktik bir çerçeveye yerleştirin ve kauçuk uçlar veya yırtılmayan kulak çubukları kullanarak başı düzeltin. Cerrahi alanın iyice dezenfeksiyonundan sonra, kafanın üst kısmında kesi yerleştirmek için bir neşter kullanın ve ön bacaklara kadar kesi devam etmek için makas kullanın.
Bulldog kelepçeler yardımıyla kafatası ortaya ve steril bir pamuk uçlu aplikatör ile periost silin. Bir kalemi veya siyah mürekkeple boyanmış bir kanülin ucunu bregma ile hizalayın ve kafatasındaki beyin kanülleri için üç giriş noktasını işaretlemek için uygun koordinatları kullanın. Daha sonra, bazal gangliyonlar için belirlenen çift kanüller ve beyincik için belirlenen tek kanül için delikleri dikkatlice delin.
Striatum ve beyincik arasında küçük bir vida için dördüncü bir delik delin. Bu vida sonunda diş çimentogömülü olacak ve kanüller için ek tutun sağlar. Hayvanların her iki tarafında ozmotik pompa için küçük bir cep oluşturmak için, deri altı doku katmanları ayırmak için doku forseps kullanın.
Bir arka bacak doğru forceps ilerleyin ve deri altı cebi genişletmek için biraz forceps açın. Diğer taraf için aynı işlemi tekrarlayın, önce forsepsleri kesiden çıkarıp sonra yavaşça ikinci arka baca doğru itin. Forceps yardımıyla, dikkatle her deri altı cebine pompaları ve bağlı kateter yerleştirin.
Cep, pompanın kolayca içeri kaymasını sağlayacaktır. Bir mini pompa tutucu kullanarak, beyincik orta hattında delinmiş delik içine 3.0 milimetre özel bir uzunlukta tek bir ozmotik kanül tanıtmak. Kanül başını dikkatlice ayırın ve kanül yanı sıra diş çimentosu ile küçük vida düzeltmek, ozmotik pompa boru için bağlantı parçası kapsayacak şekilde değil dikkat.
Kanül çevreleyen diş hekimi çimento tamamen ameliyat ile devam etmeden önce kurutulmuş olduğundan emin olun. Bazal gangliyonun üzerinde çift katlı deliklere çift kanül takmadan önce, çift kanülün iki bağlantı parçasına 0,5 santimetre uzunluğunda iki vinil boru parçası takın. Vinil boruları çatallanma adaptörüyle bağlayın ve steril ouabain solüsyonu veya aracıyla tüm tüp sistemini dikkatlice önceden doldurun.
Daha sonra, tek kanül için daha önce gösterildiği gibi aynı adımları tekrarlayın ve diş çimentosu ile çift kanül sabitleme tarafından sona erer. Ozmotik pompaların kateterlerini çatallanma adaptörüne ve tek bir kanüle bağlayın. Her iki pompa da eşit akış hızına sahiptir, bu yüzden ozmotik pompayı bifurkasyon adaptörüne çift konsantre çözeltiile bağlayarak aynı konsantrasyonun hem bazal ganglia'ya hem de beyincik'e ulaşmasını sağlamaya özen.
Deri aşırı germe olmadan mümkün olduğunca dikiş ile hayvanların arkasındaki kesi kapatın. Subkutan steril salin enjekte, dehidratasyon önlemek için vücut ısısı olmalıdır. Hayvanı stereotaktik çerçeveden çıkarın ve kurtarma kafesine yerleştirin.
Distoni benzeri hareketleri teşvik etmek için, ouabain perfüzyon fareler ameliyattan dört saat sonra hafif bir stres paradigması olarak zorlu motor görevlere maruz kalmalı ve her 24 saatte bir tekrarlanmalıdır. Bu hayvanların davranışsal bir karakterizasyonu içermez. Burada, 50 santimetrelik pürüzlü bir yüzey ahşap direğe yerleştirilen, burnu aşağıya bakan bir araç lakaplı hayvan örneğini gösteriyoruz.
Düşme durumunda direğin tabanında yeterli yatak sağlayın. Ouabain perfüzyon fareler için, hayvanlar bradikinezi gibi ilk belirtileri sunmaya başlamalıdır ameliyat sonrası dört saat. Ancak, ameliyattan 24 saat sonra, iniş sırasında distoni benzeri hareketlerin bir işareti olarak ön veya arka ekstremitelerin istemsiz hiperuzantısı görmelisiniz.
Fareler direğe üç kez inmeli, her iniş arasında en az iki dakikalık iyileşmeye izin vermelidir. İniş zamanının ölçülmesi gerekmez. Kutup testi dönen bir çubuk kullanılarak ikinci bir motor görevi tarafından izlenmelidir.
Rotarod performans testi için yapıldığı gibi, gerilim gruplarından ouabain ve araç perfüzyonlu fareler dönen çubuk üzerine yerleştirilir. Düşme gecikmesinin ölçülmesi gerekmez. Önceki testte olduğu gibi, fareler dönen çubuk üzerine üç kez yerleştirilmelidir, bu da iki dakikalık iyileşmenin iki dakika arayla yapılmasını sağlar.
Değiştirilmiş distoni derecelendirme ölçeği, farelerin distoni benzeri hareketlerinin sıklığını, şiddetini ve vücut dağılımını değerlendirmek için kullanılabilir. Hayvanlar plastik veya ahşap bir kutuya yerleştirilmeli ve hareketler dört dakikalık bir süre için kaydedilmelidir. Puanlayıcılar grup atamasına kör edilmeli.
Distoni benzeri olarak kabul edilen hareketler veya duruşlar ön ekstremitelerin istemsiz hiperuzantısı, geniş bir duruş veya arka ekstremitelerin hiperuzantısı ve kifozdur. Sadece bir vücut parçası etkilenirse, distoni odak olarak kabul edilmelidir. Gövde ve en az iki diğer vücut parçaları etkilenirse, distoni genelleştirilmiş olarak kabul edilmelidir.
Sıfırdan sekiz puana kadar yeni geliştirilen ikinci bir puanlama sistemi, kuyruk süspansiyon testi sırasında distoni benzeri hareketlerin varlığını ve şiddetini değerlendirir. Test için fareyi tabanının yanındaki kuyruğun yanından iki dakika tutun. Kuyruk süspansiyon testinin kaydedilmesi ve görüntülerin sonraki analizine bir puan ataması önerilir.
Ön uzuvlar sıfırdan dört puana kadar puanlandırılır. Her iki ön ekstremitenin tekrarlanan veya sürekli tonik geri çekilmeleri ve ön ekstremitelerin geçişi ile birlikte hiperuzatma distoni benzeri olarak puanlandırılır. Arka ekstremitelerin distoni benzeri hareketleri, geri çekilme ve sıkma anlamına gelir, yanı sıra sürekli hiperuzantısı, sıfırdan üç puana kadar puanlandırılır.
Kaydedilen sürenin %80'inden fazlabir kısmını içeren bir truncal distorsiyon ek bir puanla puanlandırılır. Arka ekstremite clasping motor bozukluğu için nonspesifik bir işarettir ve puan olmamalıdır. Bu grafik, distoni derecelendirme ölçeğinin sonuçlarını gösterir.
Ouabain perfüzyon stresli fareler stres olmayan ouabain perfüzyon grup daha 72 saatlik bir gözlemsel süre içinde önemli ölçüde daha fazla distoni benzeri hareketler mevcut, yanı sıra araç hayvanlar. Bu resim kuyruk süspansiyon testinin sonuçlarını gösterir ve distoni derecelendirme ölçeğine benzer bir sonucu gösterir. Her zaman puanı için her hayvanın toplam puanı ortalama sonuçları unutmayın.
Bu videoyu izledikten sonra, stereotaksik olarak birden fazla beyin kanüllerini stereotaksik olarak nasıl yerleştirebileceğinizi ve ozmotik pompaları subkutan olarak nasıl yerleştirebileceğinizi iyi anlamalısınız. Bu yöntemin ana avantajı tekrarlayan ve stresli enjeksiyonlar önlenebilir ve ouabain gibi bir substrat, aksi takdirde sistem çapında yan etkileri doğrudan belirli bir beyin yapılarına teslim edilebilir olmasıdır.
