המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר את ההליכים המעורבים בהקמת מודל עכבר סימפטומטי, תרופתי עבור דיסטוניה DYT / PARK-ATP1A3 באמצעות cannulas המוח במשאבות osmotic ועל ידי גרימת מתח באמצעות משימות מוטוריות מאתגרות. שיטה זו מפרטת כיצד להקים מודל עכבר תרופתי באמצעות אספקת תרופות כרונית באמצעות משאבות אוסמוטיות לתרפסות מוח מרובות וכיצד לגרום לפנוטיפ באמצעות משימות מוטוריות מאתגרות. פרדיגמת הלחץ המוטורי המתון מספקת גם תובנות על תפקידן של אינטראקציות גנים-סביבתיות בהפרעות תנועה, ו ניתן ליישם אותן על מודלים אחרים של מכרסמים.
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הלאומיות והמוסדיות הרלוונטיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם. התחל על ידי הכנת משאבות osmotic בסביבה סטרילית. ראשית, למלא מזרק מיליליטר אחד עם 27 מד מילוי cannula עם פתרון ouabain מסונן סטרילי או פתרון רכב.
החזק את המשאבה osmotic במצב זקוף, להכניס את cannula כל הדרך לתוך המשאבה לאט למלא את המאגר עד פתרון עודף מופיע על גבי. לאחר מכן, הכנס את מנחה הזרימה למשאבה. בזהירות להוריד את אוגן לבן של מנחה הזרימה עם מספריים ולחבר חתיכת צינורות ויניל מנחה הזרימה.
טביעה כל משאבה לתוך צינורות Eppendorf מלא באמצע הדרך עם תמיסת מלח ולשים אותם לתוך תרמוסיקלר 37 מעלות על מנת להבטיח כי קצב השאיבה מגיע למצב יציב לפני תחילת הניתוח. לאחר שהחיה נמצאת בהרדדמה עמוקה על פי פרוטוקולים שאושרו, מניחים את החיה במסגרת סטראוטקטית ומתקן את הראש באמצעות קצות גומי או פסי אוזניים שאינם קרועים. לאחר חיטוי יסודי של האזור הכירורגי, השתמש באזמל כדי למקם חתך בחלק העליון של הראש ולהשתמש במספריים כדי להמשיך את החתך עד לגפיים הקדמיות.
חשוף את הגולגולת בעזרת מהדקי בולדוג ולנגב את periosteum עם מוליך כותנה סטרילית. ליישר עט או קצה של cannular מוכתם בדיו שחור עם bregma ולהשתמש בקואורדינטות המתאימות כדי לסמן את שלוש נקודות הכניסה עבור cannulas המוח על הגולגולת. לאחר מכן, לקדוח בזהירות את החורים עבור cannular כפול המיועדים גנגליה הבסיסית ואת cannula יחיד המיועד המוח הקטן.
לקדוח חור רביעי עבור בורג קטן בין הסטריאטום והקטנת. בורג זה בסופו של דבר יהיה מוטבע מלט שיניים ולספק אחיזה נוספת עבור cannulas. על מנת ליצור כיס קטן עבור המשאבה osmotic בכל צד של בעלי החיים בחזרה, להשתמש מלקחיים רקמה להפריד את שכבות רקמה תת עורית.
לקדם את המדפים לכיוון רגל אחורית אחת ולפתוח את המדפים מעט על מנת להרחיב את הכיס התת עורי. חזור על אותו הליך עבור הצד השני, תחילה להסיר את המדפים מן החתך ולאחר מכן דוחף אותם בעדינות לכיוון הרגל האחורית השנייה. בעזרת ממטרים, הכנס בזהירות את המשאבות ואת הקטטר המחובר לכל כיס תת עורי.
הכיס אמור לאפשר למשאבה להחליק פנימה בקלות. באמצעות מחזיק משאבה מיני, להציג cannula osmotic יחיד עם אורך מותאם אישית של 3.0 מילימטרים לתוך החור שנקדח באמצע קו המוח הקטן. נתק את ראש הצינורית בזהירות ותקן את הצינורית, כמו גם את הבורג הקטן עם מלט דנטלי, דואג לא לכסות את החלק המחבר עבור צינורות של המשאבה osmotic.
ודא כי מלט רופא השיניים המקיף את cannula התייבש באופן מלא לפני שתמשיך עם הניתוח. לפני החדרת הצינורית הכפולה לתוך החורים שנקדחו דו-צדדית מעל הגחמות הבסיסיות, חבר שתי חתיכות ארוכות של צינורות ויניל באורך 0.5 ס"מ לשתי החלקים המחברים של הצינורית הכפולה. חבר את צינורות ויניל עם מתאם bifurcation בזהירות מראש את המערכת צינורות כולו עם פתרון ouabain סטרילי או רכב.
לאחר מכן, לחזור על אותם שלבים כפי שהוצג בעבר עבור cannula יחיד ולסיים על ידי תיקון cannula כפול עם מלט שיניים. חבר את הקטטרים של משאבות אוסמוטי מתאם bifurcation, כמו גם cannula יחיד בהתאמה. שתי המשאבות יש קצב זרימה שווה כדי להיזהר לחבר את המשאבה osmotic עם פתרון מרוכז כפול מתאם bifurcation כדי להבטיח כי אותו ריכוז מגיע הן את הגנגליה הבסיסית ואת המוח הקטן.
סגור את החתך על גב בעלי החיים עם תפרים ככל האפשר מבלי לטרטר את העור. תת עורית להזריק מלוחים סטריליים, אשר צריך להיות טמפרטורת הגוף, כדי למנוע התייבשות. מוציאים את החיה מהמסגרת הסטראוטקטית ומ מניחים אותה בכלוב התאוששות.
על מנת לגרום לתנועות כמו דיסטוניה, עכברים ouabain-perfused צריך להיות חשוף למשימות מוטוריות מאתגרות כמו פרדיגמת מתח קלה ארבע שעות לאחר הניתוח וחוזר על עצמו כל 24 שעות לאחר מכן. זה לא כולל אפיון התנהגותי של בעלי החיים. אנו מדגימים כאן את הדוגמה של בעל חיים מנוון רכב, אשר ממוקם על מוט עץ משטח מחוספס 50 ס"מ, האף פונה כלפי מטה.
לספק מספיק מצעים בבסיס העמוד במקרה של נפילות. עבור עכברים ouabain-perfused, בעלי החיים צריכים להתחיל להציג סימפטומים ראשונים כמו bradykinesia ארבע שעות לאחר הניתוח. עם זאת, 24 שעות לאחר הניתוח, אתה צריך לראות יתר לחץ דם לא רצוני של הגפיים הקדמיות או האחוריות כסימן של תנועות כמו דיסטוניה במהלך הירידה.
העכברים צריכים לרדת מהמוט שלוש פעמים, לאפשר לפחות שתי דקות של התאוששות בין כל ירידה. אין צורך למדוד את זמן הירידה. מבחן המוט צריך להיות מלווה במשימה מוטורית שנייה, באמצעות מוט מסתובב.
כפי שנעשה עבור מבחן הביצועים Rotarod, ouabain ועכברים מנוקב רכב מקבוצות הלחץ ממוקמים על מוט מסתובב. ההשהיה ליפול לא צריכה להימדד. כפי שנעשה עבור הבדיקה הקודמת, עכברים צריכים להיות ממוקמים על מוט מסתובב שלוש פעמים, המאפשר שתי דקות של התאוששות בין ריצות.
ניתן להשתמש בסולם דירוג הדיסטוניה שהשתנה כדי להעריך את התדירות, החומרה והתפלגות הגוף של תנועות עכברים דמויי דיסטוניה. בעלי החיים צריכים להיות ממוקמים בקופסת פלסטיק או עץ ויש להקליט תנועות לתקופת זמן של ארבע דקות. יש לעוור את המדרגים למשימה הקבוצתית.
תנועות או יציבות הנחשבות כמו דיסטוניה הן יתר לחץ דם לא רצוני של הגפיים הקדמיות, עמדה רחבה, או יתר לחץ דם של גפיים אחוריות, כמו גם קיפוזיס. אם רק חלק גוף אחד מושפע, דיסטוניה צריכה להיחשב כמו מוקד. אם תא המטען ולפחות שני חלקי גוף אחרים מושפעים, יש לראות בדיסטוניה כהכללה.
מערכת ניקוד שנייה שפותחה לאחרונה מאפס לשמונה נקודות, מעריכה את הנוכחות והחומרה של תנועות דמויי דיסטוניה במהלך בדיקת השעיית זנב. למבחן, להחזיק את העכבר על ידי הזנב ליד הבסיס שלה במשך שתי דקות. מומלץ להקליט את מבחן השעיית הזנב ולהקצות ציון לניתוח הבא של הצילומים.
הגפיים הקדמיות מבקיעות מאפס לארבע נקודות. נסיגות טוניק חוזרות ונשנות או מתמשכות של אחת משתי הגפיים הקדמיות, כמו גם יתר לחץ דם בשילוב עם חציית הגפיים הקדמיות הם הבקיע כמו דיסטוניה. תנועות כמו דיסטוניה של הגפיים האחוריות, כלומר נסיגה והתכווכת, כמו גם יתר לחץ דם מתמשך, הם הבקיע מאפס לשלוש נקודות.
עיוות truncal נוכח מעל 80% מהזמן המתועד הוא הבקיע עם נקודה נוספת. אבזם גפיים אחורי הוא סימן לא ספציפי לפגיעה מוטורית ואין להבקיע אותו. גרף זה מציג את התוצאות של סולם דירוג הדיסטוניה.
העכברים הדגיש ouabain-perfused להציג באופן משמעותי יותר תנועות דמויי דיסטוניה על פני תקופה תצפיתית של 72 שעות מאשר הקבוצה שאינה מתח ouabain חדור, כמו גם את חיות הרכב. תמונה זו מתארת את התוצאות ממבחן המתלים של הזנב ומראה תוצאה דומה לסקאלה של דירוג דיסטוניה. שים לב כי התוצאות של הממוצע מן הציון הכולל של כל בעל חיים עבור כל נקודת זמן.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה כיצד להשתיל באופן סטריאוטיפי cannulas המוח מרובים וכיצד להשתיל תת עורית משאבות osmotic. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי זריקות חוזרות ומלחיצות ניתן להימנע כי מצע כמו ouabain, אשר אחרת היו תופעות לוואי כלל מערכתית ניתן להעביר ישירות למבני מוח ספציפיים.
