Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Verfahren zu beschreiben, die bei der Erstellung eines symptomatischen, pharmakologischen Mausmodells für DYT/PARK-ATP1A3-Dystonie durch den Einsatz von Hirnkanülen in osmotischen Pumpen und durch die Induktion von Stress durch herausfordernde motorische Aufgaben involviert sind. Diese Methode beschreibt, wie man ein pharmakologisches Mausmodell mit chronischer Medikamentenabgabe über osmotische Pumpen an mehrere Gehirnkanülen erstellt und wie man den Phänotyp durch herausfordernde motorische Aufgaben induziert. Das Paradigma des milden motorischen Stresses gibt auch Einblicke in die Rolle von Gen-Umwelt-Wechselwirkungen bei Bewegungsstörungen und kann auf andere Nagetiermodelle angewendet werden.
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den geltenden nationalen und institutionellen Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der osmotischen Pumpen in einer sterilen Umgebung. Füllen Sie zunächst eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27 Gauge Füllkanüle mit steriler gefilterter Ouabain-Lösung oder Fahrzeuglösung.
Halten Sie die osmotische Pumpe in aufrechter Position, legen Sie die Kanüle bis zur Pumpe ein und füllen Sie das Reservoir langsam, bis eine überschüssige Lösung oben erscheint. Fügen Sie als Nächstes den Strömungsmoderator in die Pumpe ein. Nehmen Sie vorsichtig den weißen Flansch des Flow-Moderators mit einer Schere ab und verbinden Sie ein Stück Vinylschlauch mit dem Flow-Moderator.
Jede Pumpe in Eppendorf-Rohre untertauchen, die auf halbem Weg mit einer Salinelösung gefüllt sind, und legen Sie sie in einen Thermocycler um 37 Grad, um sicherzustellen, dass die Pumpleistung vor Beginn der Operation einen stabilen Zustand erreicht. Nachdem das Tier nach zugelassenen Protokollen tief beäpft iert wurde, legen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen und fixieren Sie den Kopf mit Gummispitzen oder nicht gebrochenen Ohrstangen. Nach gründlicher Desinfektion des Operationsbereichs verwenden Sie ein Skalpell, um den Schnitt an der Oberseite des Kopfes zu platzieren und verwenden Sie eine Schere, um den Schnitt bis zu den Vorderteilen fortzusetzen.
Den Schädel mit Hilfe von Bulldoggenklemmen aussetzen und das Periost mit einem sterilen, mit Baumwolle gekippten Applikator abwischen. Richten Sie entweder einen Stift oder die Spitze eines in schwarzer Tinte gefärbten Kanülen mit Bregma aus und verwenden Sie die entsprechenden Koordinaten, um die drei Einstiegspunkte für die Hirnkanülen auf dem Schädel zu markieren. Als nächstes bohren Sie sorgfältig die Löcher für den Doppelkanülen, der für die Basalganglien und die für das Kleinhirn vorgesehene Einzelkanüle bestimmt ist.
Bohren Sie ein viertes Loch für eine kleine Schraube zwischen dem Striatum und dem Kleinhirn. Diese Schraube wird schließlich in Zahnzement eingebettet und bieten zusätzlichen Halt für die Kanülen. Um eine kleine Tasche für die osmotische Pumpe auf jeder Seite des Tieres zurück zu schaffen, verwenden Sie Gewebezange, um die subkutanen Gewebeschichten zu trennen.
Bewegen Sie die Zange auf ein Hinterbein und öffnen Sie die Zange leicht, um die subkutane Tasche zu erweitern. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für die andere Seite, zuerst entfernen Sie die Zange aus dem Schnitt und schieben Sie sie dann sanft in Richtung des zweiten Hinterbeins. Mit Hilfe von Zangen, legen Sie die Pumpen und den angeschlossenen Katheter sorgfältig in jede subkutane Tasche.
Die Tasche sollte es der Pumpe ermöglichen, leicht einzurutschen. Mit einem Mini-Pumpenhalter, führen Sie eine einzelne osmotische Kanüle mit einer benutzerdefinierten Länge von 3,0 Millimetern in das Loch in der Mittellinie des Kleinhirns gebohrt. Lösen Sie den Kanülenkopf sorgfältig und fixieren Sie die Kanüle sowie die kleine Schraube mit Zahnzement, wobei darauf geachtet wird, das Verbindungsstück für die Schläuche der osmotischen Pumpe nicht zu bedecken.
Stellen Sie sicher, dass der Zahnmannzement, der die Kanüle umgibt, vollständig getrocknet ist, bevor Sie mit der Operation fortfahren. Bevor Sie die Doppelkanüle in die bilateral gebohrten Löcher oberhalb der Basalganglien einsetzen, befestigen Sie zwei 0,5 Zentimeter lange Vinylschläuche an den beiden Verbindungsstücken der Doppelkanüle. Verbinden Sie die Vinylschläuche mit einem Bifurkationsadapter und füllen Sie das gesamte Schlauchsystem sorgfältig mit steriler Ouabain-Lösung oder Fahrzeug aus.
Wiederholen Sie als Nächstes die gleichen Schritte wie zuvor für die einzelne Kanüle gezeigt und enden, indem Sie die Doppelkanüle mit Zahnzement fixieren. Schließen Sie die Katheter der osmotischen Pumpen an den Bifurkationsadapter bzw. eine einzelne Kanüle an. Beide Pumpen haben eine gleiche Durchflussrate, also achten Sie darauf, die osmotische Pumpe mit einer doppelt konzentrierten Lösung an den Bifurkationsadapter zu verbinden, um sicherzustellen, dass die gleiche Konzentration sowohl die Basalganglien als auch das Kleinhirn erreicht.
Schließen Sie den Schnitt auf dem Rücken der Tiere so weit wie möglich mit Stichen, ohne die Haut zu überdehnen. Subkutan einjizieren Sterile Saline, die Körpertemperatur haben sollte, um Austrocknung zu vermeiden. Entfernen Sie das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie es in den Bergungskäfig.
Um Dystonie-ähnliche Bewegungen zu induzieren, sollten Ouabain-perfundierte Mäuse vier Stunden nach der Operation und alle 24 Stunden wiederholt herausfordernden motorischen Aufgaben als mildes Stressparadigma ausgesetzt werden und sich alle 24 Stunden wiederholen. Dies schließt keine Verhaltenscharakterisierung der Tiere ein. Wir zeigen hier das Beispiel eines fahrzeugdurchlässigen Tieres, das auf einen 50 Zentimeter rauen Holzpfahl mit nach unten gerichteter Nase platziert wird.
Geben Sie bei Stürzen genügend Bettwäsche an der Basis der Stange an. Bei ouabain-perfused Mäusen sollten die Tiere beginnen, erste Symptome wie Bradykinesie n. Chr. vier Stunden nach der Operation zu zeigen. Jedoch, 24 Stunden nach der Operation, sollten Sie unwillkürliche Hyperextension der vorderen oder hinteren Gliedmaßen als Zeichen von Dystonie-ähnliche Bewegungen während des Abstiegs sehen.
Die Mäuse sollten den Pol dreimal absteigen, mindestens zwei Minuten Erholung zwischen jedem Abstieg ermöglichen. Die Zeit des Abstiegs muss nicht gemessen werden. Auf die Stabprüfung sollte eine zweite Motoraufgabe mit einer rotierenden Stange folgen.
Wie beim Rotarod-Leistungstest werden die Ouabain- und Fahrzeugmäuse aus den Belastungsgruppen auf den rotierenden Stab gelegt. Die Latenz zu fallen muss nicht gemessen werden. Wie beim vorherigen Test sollten Mäuse dreimal auf den rotierenden Stab gelegt werden, so dass zwischen den Läufen zwei Minuten Erholung möglich sind.
Die modifizierte Dystonie-Bewertungsskala kann verwendet werden, um die Häufigkeit, schwere und Körperverteilung von Dystonie-ähnlichen Bewegungen von Mäusen zu bewerten. Die Tiere sollten in einer Plastik- oder Holzkiste untergebracht werden und Bewegungen sollten für einen Zeitraum von vier Minuten aufgezeichnet werden. Die Bewerter sollten für die Gruppenzuweisung geblendet werden.
Bewegungen oder Haltungen, die als Dystonie-ähnlich angesehen werden, sind die unfreiwillige Hyperextension der vorderen Gliedmaßen, eine breite Haltung, oder Hyperextension der Hinterbeine, sowie Kyphose. Wenn nur ein Körperteil betroffen ist, sollte Dystonie als fokal betrachtet werden. Wenn der Stamm und mindestens zwei andere Körperteile betroffen sind, sollte Dystonie als verallgemeinert betrachtet werden.
Ein zweites neu entwickeltes Punktesystem von null auf acht Punkte bewertet das Vorhandensein und die Schwere von Dystonie-ähnlichen Bewegungen während eines Schwanzsuspensionstests. Halten Sie für den Test die Maus am Schwanz in der Nähe ihrer Basis für zwei Minuten hoch. Es wird empfohlen, den Schwanzfederungstest aufzuzeichnen und der nachfolgenden Analyse des Filmmaterials eine Punktzahl zuzuweisen.
Die vorderen Gliedmaßen werden von null auf vier Punkte erzielt. Wiederholte oder anhaltende Tonic-Retraktionen eines der beiden vorderen Gliedmaßen, sowie die Hyperextension kombiniert mit der Kreuzung der vorderen Gliedmaßen werden als Dystonie-like bewertet. Dystonie-ähnliche Bewegungen der Hinterbeine, d.h. Rückzug und Klammern, sowie anhaltende Hyperextension werden von null auf drei Punkte erzielt.
Eine Abgeschnittene Verzerrung, die über 80 % der aufgezeichneten Zeit vorliegt, wird mit einem zusätzlichen Punkt bewertet. Hintere Gliedmaßenumschlüsse sind unspezifische Zeichen für motorische Beeinträchtigung und sollten nicht bewertet werden. Diese Grafik zeigt die Ergebnisse der Dystonie-Bewertungsskala.
Die ouabain-perfused gestressten Mäuse zeigen deutlich mehr Dystonie-ähnliche Bewegungen über einen Beobachtungszeitraum von 72 Stunden als die nicht-Stress-Ouabain-perfused Gruppe, sowie die Fahrzeugtiere. Dieses Bild zeigt die Ergebnisse des Schwanzsuspensionstests und zeigt ein ähnliches Ergebnis wie die Dystonie-Bewertungsskala. Beachten Sie, dass die Ergebnisse des Mittelwerts aus der Gesamtpunktzahl jedes Tieres für jeden Zeitpunkt.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mehrere Gehirnkanülen stereotaxisch implantieren und wie Sie subkutan osmotische Pumpen implantieren können. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass repetitive und stressige Injektionen vermieden werden können und dass ein Substrat wie Ouabain, das sonst systemweite Nebenwirkungen hätte, direkt an eine bestimmte Hirnstruktur abgegeben werden kann.
