Эта модель микрофлюидного рака на чипе, которую мы называем ускорителем эволюции, обеспечивает управляемую платформу для долгосрочных количественных исследований динамики рака в режиме реального времени в рамках четко определенных условий окружающей среды на уровне одной клетки. Технология позволяет исследовать эволюционную динамику рака под опухолевым стрессовым ландшафтом. Предоставление информации, включая морфологию, население, подвижность и миграцию с течением времени на клеточном уровне.
С возможностью контролировать и контролировать поведение смешанных опухолевых популяций под хорошо контролируемыми градиентами стресса наша технология может представить более физиологически релевантную модель для развития доклинкологических препаратов. Представленный метод уплотнения давления может быть также реализован в других микрофлюидных системах, что требует сложной корректировки состава окружающего газа, а также мощности эксперимента ниже по течению. Ключом к успешному проведению долгосрочного эксперимента является обеспечение физической и биохимической стабильной среды.
Необходимо постоянно контролировать такие факторы, как температура, влажность и состав газа. Для начала изготовите держатель пластины, которого достаточно для одновременного держать газоназной культуры блюд на 3D-печатной машине. Отвинтить компоненты настроенных трех хорошо образец пластины с винтом водителя.
Дезинфицировать компоненты с помощью УФ-облучения, по крайней мере один час и оставить в стерильной среде. Для начала посева клеточной линии добавьте пять миллилитров трипсина в каждую культуру клеток PC3-Epi или PC3-EMT в 10-сантиметровом блюде культуры и запустите трипсинизацию в течение пяти минут в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию. Перенесите клетки из культурных блюд в 15 миллилитровых центрифуг, а затем центрифугу по 150 раз г в течение трех минут.
Откажитесь от супернатанта. Повторно приостанавливайте каждую из клеточных гранул в 15 миллилитровых центрифугах и подсчитывайте клетки каждого PC3-MP или PC3-EMT с помощью гемоцитометра. Изолировать в общей сложности 2,5 раза от 10 до четырех из каждого типа ячейки.
Смешайте два изолированных типа клеток и добавьте в два миллилитров культурных средств массовой информации. Семя два миллилитров клеточной культуры в каждом из трех газовых проницаемых блюд культуры. Оставьте газ проницаемым в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию в течение ночи для клеток, чтобы прикрепить.
Дезинфицировать устройства PDMS с помощью УФ-облучения, по крайней мере один час и оставить в стерильной среде. Теперь создана система газоснабжения, которая состоит как из двуокиси углерода, так и из блоков управления кислородом, газового насоса, газосмешиваяовой камеры, увлажнителя или пузырька, а также трех отдельных наборов газовых клапанов и датчиков давления. Кроме того, используйте систему газоснабжения, которая обеспечивает состояние нормоксии.
Убедитесь, что относительная влажность в камере смешивания увеличивается до более чем 85%Настройка на сцене инкубационный тепловой блок управления при 37 градусах по Цельсию с отдельными нагревательных подубнизу для крышки и нижней пластины. На следующий день вынюхить газ проницаемые блюда культуры из инкубатора и определить, что подробные компоненты в порядке, Каждая хорошо обладает газом проницаемой культуры блюдо держатель, PDMS чип держатель, стеклянный держатель окна, и пара 35 миллилитров широкие стеклянные окна. Используйте установленные винты, чтобы собрать эти компоненты и зажать газ проницаемой культуры блюдо.
Затем перенесите предварительно разогретую культурную среду в вакуумную камеру для де-газа в течение 20 минут. Лечить чип PDMS в кислородной плазменной системе в течение 30 секунд для поддержания гидрофиличность. Следующая загрузка двух шприцев медленно с 10 миллилитров де-газированного роста средств массовой информации и два других шприцев с 10 миллилитров де-газированы желаемого реагента интереса.
Например средства массовой информации и средства массовой информации с наркотиками. Соедините каждый отдельный шприц с 50-сантиметровой трубкой с помощью 23-калиберной иглы в одну полую стальную булавку. Вставьте полую стальную булавку в другой конец трубки.
Нажмите средства массовой информации в трубы, чтобы премьер трубки и вставить стальной штифт в каждый чип PDMS через укупорки слоя. Заполните слой резервуара и промокните слой шаблона PDMS с помощью мультимедиа. Слой резервуара работает как ловушка пузыря на чипе, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха в микрофлюидную модель.
Затем загрузите один миллилитровый шприц с культурными средствами массовой информации. Соедините шприц с пятиметровой трубкой с помощью 23-калиберной иглы в одну полую стальную булавку. Вставьте полый стальной штырь в другой конец трубки и премьер трубки.
Вставьте полый стальной штифт в центральное отверстие чипа для чрезмерного средства массовой информации, которые будут извлечены позже. Загрузите два 10 миллилитровых шприцев на чип в передней палубе и поместите два других шприца в палубу для снятия шприца системы. Для того, чтобы избежать entrapping microbubbles в микрофлюидной картины, обойтись один миллилитр предварительно разогретых и де-газированных средств массовой информации в 35 миллилитров глубокого газа проницаемой культуры блюдо.
Распоить микросхемы непосредственно на верхней части газонаводных мембран культуры, где чип приближается к жидкой поверхности с углом наклона 15 градусов. Зажим чип PDMS с держателем чипа PDMS, толкая устройство PDMS вниз. Лента лист герметика на верхней части устройства PDMS и зажим с держателем чипа PDMS, с тем чтобы предотвратить чип от высыхания.
Установите скорость потока мультимедиа вокруг массива, чтобы быть 20 микролитров в час. Распоить всю пластину в инкубаторе на сцене на моторизованной сцене перевернутого микроскопа. Подключите систему газоснабжения к газовым каналам через газовые трубы и поддерживайте давление датчика на уровне 0,2 PSI.
Это давит на газоназную мембрану культуры против установленного чипа PDMS для обеспечения уплотнения устройства. Медленно извлекайте из центральной дыры чрезмерное количество средств массовой информации в чипе с помощью одного миллилитрового шприца. Наблюдайте за чипом под микроскопом во время извлечения мультимедиа, а затем прекратите извлечение, когда чип запечатан.
Соедините блок зондирования температуры инкубатора на сцене с тремя пластинами и установите до 37 градусов по Цельсию. В этом исследовании PC3, культурный в ускорителе эволюции без присутствия внешнего стресса, имел кривые роста при выравниваниях. Предлагая идентичность профиля пролиферации ячейки в качестве функции положения по всему чипу.
Первоначальный наклон кривых показывает скорость распространения. Удвоение времени для ячеек в устройстве составляет около 24 часов. GFP выражая PC3-EMT и mCherry выражая PC3-Epi клетки выстроились были совместно культурны в ускорителе эволюции.
Начиная с 40%слияния кокультура выросла на 40% в течение трех дней. В то время как кривая роста общего слияния в виде модели логистического роста. Популяция PC3-EMT продолжала расширяться, и PC3-Epi был подавлен в асимптотической фазе.
Pc3-Epi и PC3-EMT клетки были плотно сидя в центре устройства и было разрешено свободно мигрировать в сторону пустой области. Нормализованная гистограмма скорости скорости обоих фенотипов показывает, что скорость PC3-EMT была значительно выше, чем PC3-Epi, в 1,8 раза. Очень важно, чтобы избежать создания microbubbles любой ценой в то время как культурные средства массовой информации должны быть предварительно разогреты и де-газы.
Чип PDMS следует правильно смочить и аккуратно обработать. Из-за мягкой повторной герметизации нашего метода уплотнения давления многие эксперименты вниз по течению могут быть предварительно сформированы. Такие, как субклиническая добыча популяции, местный метаболитный анализ и пространственно разрешенная иммунофлуоресценция и секвенирование.
Наша технология демонстрирует способ комплексного воспроизведения ключевых компонентов и взаимодействий в сложной суперми микро-среде. Тем не менее, достаточно простой, чтобы обеспечить количественные, надежные и воспроизводимые данные.
