Этот протокол предусматривает пошаговую процедуру отбора проб субслойных мембран perivitelline из птичьих яиц для дальнейшего исследования их физиологической роли в воспроизводстве птиц. Выборка перивиллиновой мембраны была оптимизирована на каждом шагу, чтобы ограничить любые структурные и молекулярные повреждения. Протокол был дополнительно разработан для глубокой протеомии.
Начните с отбора проб слоя перивителлина или PL из свежеотложенного нефертилизованного яйца. Разбейте яйцо и используйте яичный сепаратор, чтобы отделить желток от белого. Удалите chalazae с небольшими ножницами и свернуть желток на фильтровальную бумагу, чтобы удалить приверженец альбумин, который появляется как прозрачная, но видимая структура.
Погрузите желток в кристаллизатор, содержащий 10 миллимоляр Tris HCL при рН восемь, который ранее был охлажден до четырех градусов по Цельсию и удалить PL области над зародышевым диском в пределах одного сантиметра зоны с помощью тупых ножниц. Разрыв PL с небольшими ножницами внутри буфера, а затем провести два края разрыва PL с типсами и очистить его от желтка. Промыть PL несколько раз в ванне 10 миллимоляр Tris HCL, пока не видны следы желтка.
Убедитесь, что PL чист, белый и плавает в буфере. Обработать PL для разделения субслойного или перейти непосредственно к биохимическим анализам. Чтобы отделить OPL и IPL, распространение весь образец с OPL лицом вверх в пластиковой чашке Петри заполнены 10 миллимоляр Tris HCL и 50 миллимоляр хлорида натрия и поддерживать его плоским с как можно меньше морщин, как это возможно.
Определите местоположение оставшихся чалаза, которые прикрепляются только к OPL. Затем разрежьте весь PL на кусочки около двух на три сантиметра маленькими ножницами. Механически отделить два слоя с ультра точные типсы кончика под рассечением микроскопа.
Храните полученные образцы IPL и OPL индивидуально в микротрубках при отрицательном 80 градусах цельсия до дальнейшего использования. Для выполнения первичной солубилизации белка, заморозить сухой IPL и OPL образцов индивидуально, чтобы удалить оставшуюся воду, а затем вырезать примерно один миллиграмм из каждого образца и поместить его в чистую микротрубку с утечкой доказательство винт крышкой. Храните оставшиеся образцы в плотно закрытых трубках для длительного хранения при отрицательных 20 или отрицательных 80 градусах по Цельсию.
Смешайте один миллиграмм каждого лиофилизированного подслойщика с 400 микролитров 50 миллимолярные три при рН семь и 500 миллимолярный хлорид натрия. Используйте смеситель мельницы дважды в течение пяти минут в 30 Герц, чтобы распасть структуры на микрочастицы и облегчить белка solubilization. Соберите 400 микролитров образцов в две чистые микротрубки.
Чтобы подготовить образцы для электрофореза, добавьте буфер образца 5X SDS-PAGE к каждому образцу микролитров и нагревайте его до 100 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Загрузите максимум 20 микрограммов белков в каждую полосу 4-20%-градиентного полиакриламинида SDS и выполняйте электрофорез на 120 вольт. После электрофорез, удалить гель из стеклянных пластин и пятно его с Coomassie Блестящий синий раствор в течение 30 минут, а затем де-пятно с раствором, состоящим из 50%воды, 40% этанола и 10%acetic кислоты, пока гель фон появляется светло-голубой.
Перенесите гель в чашку Петри, содержащую деионизированную воду для обезвоживания и повторного увлажнения. Белки должны отображаться как синие полосы с прозрачным фоном. PL был подвергнут различным буферам для определения условий, позволяющих минимальную потерю белка и оптимальное разделение подслой.
Здесь показаны белки, высвобождаемые при различных концентрациях трис, рН и хлорида натрия. Полученные два подслоя были замечены под рассеченным микроскопом. IPL полупрозрачный, в то время как OPL плотный, облачный и беловатый.
После разделения, OPL и IPL были лиофилизированы независимо и их содержание протеина вполне было растворено используя комбинацию механически шлифования, анионического моющего средства, уменьшая агента, и кипя. Образцы продемонстрировали различные электрофоретические профили на полиакриламинидном геле. При попытке этого протокола имейте в виду, что разделение подслоев является критическим шагом процедуры и должно выполняться с помощью бинокулярного микроскопа в буфере, содержащем минимальную концентрацию соли.
Для дальнейшего выяснения их соответствующей физиологической функции, образцы субслойного мембранного подслоя перивителлина могут быть проанализированы для гистологической характеристики с использованием электронной микроскопии и для функциональных исследований с использованием анализа изображений и миграции клеток.
