Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para amostrar as subcamadas de membrana perivitelline de ovos aviários para uma investigação mais aprofundada de seu papel fisiológico na reprodução de aves. A amostragem da membrana perivitelina tem sido otimizada a cada passo para limitar quaisquer danos estruturais e moleculares. O protocolo foi desenvolvido para proteômica aprofundada.
Comece por amostragem da camada perivitelline ou PL de um ovo recém-colocado não fertilizado. Quebre o ovo e use um separador de ovos para separar a gema do branco. Remova o chalazae com uma tesoura pequena e role a gema sobre um papel filtro para remover a albumina aderente que aparece como uma estrutura transparente, mas visível.
Mergulhe a gema em um cristalizador contendo 10 milimôlars Tris HCL no pH oito que foi previamente resfriado a quatro graus Celsius e remova a área pl sobre o disco germinal dentro de uma zona de um centímetro usando uma tesoura sem cortes. Rompa o PL com uma tesoura pequena dentro do tampão, em seguida, segure as duas bordas do PL rompido com fórceps e retire-o da gema. Enxágüe o PL várias vezes em banhos de 10 mililitros Tris HCL até que nenhum traço de gema seja visível.
Certifique-se de que o PL está limpo, branco e flutuando no buffer. Processe o PL para separação de subcamadas ou proceda diretamente a análises bioquímicas. Para separar o OPL e o IPL, espalhe toda a amostra com o OPL voltado para cima em uma placa de Petri de plástico recheada com 10 milimerlares Tris HCL e 50 mililitros de sódio e mantê-lo plano com o menor número possível de rugas.
Determine a localização do chalazae restante que está apenas anexado ao OPL. Em seguida, corte todo o PL em pedaços de cerca de dois por três centímetros com uma tesoura pequena. Separar mecanicamente as duas camadas com fórceps de ponta ultra precisas sob um microscópio dissecando.
Armazene as amostras de IPL e OPL resultantes individualmente em micro tubos a 80 graus Celsius negativos até uso posterior. Para realizar a solubilização da proteína primária, congele as amostras de IPL e OPL individualmente para remover a água restante, em seguida, corte aproximadamente um miligrama de cada amostra e coloque-o dentro de um micro tubo limpo com uma tampa de parafuso à prova de vazamento. Mantenha as amostras restantes em tubos bem fechados para armazenamento prolongado a 20 negativos ou negativos 80 graus Celsius.
Misture um miligrama de cada subcamada liofilizada com 400 microlitres de 50 mililitros Tris em pH sete e 500 mililitros de sódio. Use um moinho de mistura duas vezes por cinco minutos a 30 Hertz para desintegrar as estruturas em micro partículas e facilitar a solubilização proteica. Colete 400 microliters das amostras em dois micro tubos limpos.
Para preparar as amostras para eletroforese, adicione 5X tampão de amostra SDS-PAGE a cada amostra de 400 microliteres e aqueça-a a 100 graus Celsius por cinco minutos. Carregue um máximo de 20 microgramas de proteínas em cada pista de um gel de poliacrilamida SDS de 4-20% gradiente e realize eletroforese a 120 volts. Após a eletroforese, remova o gel das placas de vidro e manche-o com a solução Coomassie Brilliant Blue por 30 minutos, depois despeite com uma solução composta por 50% de água, 40% de etanol e ácido 10% acético até que o fundo do gel pareça azul claro.
Transfira o gel para uma placa de Petri contendo água deionizada para des coloração e re-hidratação. As proteínas devem aparecer como faixas azuis com fundo transparente. O PL foi submetido a vários buffers para identificar condições que permitem perda mínima de proteína e separação ideal de subcamadas.
Proteínas liberadas em diferentes concentrações tris, pH e cloreto de sódio são mostrados aqui. As duas subcamadas resultantes foram observadas sob um microscópio dissecando. O IPL é translúcido, enquanto o OPL é denso, nublado e esbranquiçado.
Após a separação, OPL e IPL foram liofilizados de forma independente e seu teor de proteína foi completamente dissolvido usando uma combinação de moagem mecânica, um detergente aniônico, um agente redutor e ebulição. As amostras apresentaram perfis eletroforéticos distintos em um gel de poliacrilamida. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que a separação das subcamadas é uma etapa crítica do procedimento e deve ser realizada usando um microscópio binóculo em um tampão contendo uma concentração mínima de sal.
Para elucidar ainda mais sua respectiva função fisiológica, as amostras de subcamadas de membrana perivitelline podem ser analisadas para caracterização histológica utilizando microscopia eletrônica e para estudos funcionais utilizando ensaios de imagem e migração celular.
