Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zur Probe der Perivitelline-Membransublayer aus Aviären Eiern zur weiteren Untersuchung ihrer physiologischen Rolle bei der Fortpflanzung von Vögeln. Die Probenahme der Perivitelline-Membran wurde bei jedem Schritt optimiert, um strukturelle und molekulare Schäden zu begrenzen. Das Protokoll wurde für die tiefgehende Proteomik weiterentwickelt.
Beginnen Sie mit der Probenahme der Perivitellineschicht oder PL aus einer frisch gelegten unbefruchteten Eie. Brechen Sie das Ei und verwenden Sie ein Ei-Separator, um das Eigelb vom Weißen zu trennen. Entfernen Sie die Chalazae mit einer kleinen Schere und rollen Sie das Eigelb über ein Filterpapier, um das haftende Albumin zu entfernen, das als transparente, aber sichtbare Struktur erscheint.
Tauchen Sie das Eigelb in einen Kristallisator mit 10 Millimolaren Tris HCL bei pH 8, der zuvor auf vier Grad Celsius abgekühlt wurde, und entfernen Sie den PL-Bereich über der Keimscheibe innerhalb einer Zentimeterzone mit einer stumpfen Schere. Rupture die PL mit einer kleinen Schere im Puffer, dann halten Sie die beiden Kanten der gebrochenen PL mit Zange und schälen Sie es aus dem Eigelb. Spülen Sie die PL mehrmals in Bädern von 10 Millimolar Tris HCL, bis keine Spur von Dotter sichtbar ist.
Stellen Sie sicher, dass die PL sauber, weiß und im Puffer schwebend ist. Verarbeiten Sie die PL für die Sublayer-Trennung oder gehen Sie direkt zu biochemischen Analysen über. Um opL und IPL zu trennen, verteilen Sie die gesamte Probe mit der OPL nach oben in einer Kunststoff-Petrischale gefüllt mit 10 Millimolar Tris HCL und 50 Millimolar Natriumchlorid und halten Sie sie flach mit so wenig Falten wie möglich.
Bestimmen Sie den Standort der verbleibenden Chalazae, die nur an die OPL angefügt sind. Dann schneiden Sie die gesamte PL in Stücke von etwa zwei mal drei Zentimetern mit einer kleinen Schere. Trennen Sie die beiden Schichten mechanisch mit ultrapräzisen Spitzenzangen unter einem Sezierendes Mikroskop.
Bewahren Sie die resultierenden IPL- und OPL-Proben bis zur weiteren Verwendung einzeln in Mikroröhren bei minus 80 Grad Celsius auf. Um die primäre Proteinlöslichkeit durchzuführen, trocknen Sie die IPL- und OPL-Proben einzeln ein, um das verbleibende Wasser zu entfernen, schneiden Sie dann etwa ein Milligramm aus jeder Probe und legen Sie sie in ein sauberes Mikrorohr mit einem auslaufsicheren Schraubverschluss. Bewahren Sie die restlichen Proben in dicht verschlossenen Rohren für eine längere Lagerung bei negativen 20 oder negativen 80 Grad Celsius auf.
Mischen Sie ein Milligramm jeder lyophilisierten Sublayer mit 400 Mikroliter50 Millimolar Tris bei pH sieben und 500 Millimolar Natriumchlorid. Verwenden Sie eine Mischmühle zweimal für fünf Minuten bei 30 Hertz, um die Strukturen in Mikropartikel aufzulösen und die Proteinlösung zu erleichtern. Sammeln Sie 400 Mikroliter der Proben in zwei saubere Mikroröhren.
Um die Proben für die Elektrophorese vorzubereiten, fügen Sie 5X SDS-PAGE Probenpuffer zu jeder 400-Mikroliter-Probe hinzu und erhitzen Sie sie fünf Minuten lang auf 100 Grad Celsius. Laden Sie maximal 20 Mikrogramm Proteine in jede Spur eines SDS-Polyacrylamid-Gels mit 4-20% Gradienten und führen Sie die Elektrophorese bei 120 Volt durch. Nach der Elektrophorese das Gel von den Glasplatten entfernen und mit Coomassie Brilliant Blue Lösung für 30 Minuten färben, dann mit einer Lösung aus 50% Wasser, 40% Ethanol und 10% Essigsäure entflecken, bis der Gelhintergrund hellblau erscheint.
Übertragen Sie das Gel in eine Petrischale, die entionisiertes Wasser zur Entfärbung und Rehydrierung enthält. Proteine sollten als blaue Bänder mit transparentem Hintergrund erscheinen. Die PL wurde verschiedenen Puffern unterzogen, um Bedingungen zu identifizieren, die einen minimalen Proteinverlust und eine optimale Sublayer-Trennung ermöglichten.
Protein, das in unterschiedlichen Tris-Konzentrationen, pH- und Natriumchloridkonzentrationen freigesetzt wird, wird hier gezeigt. Die resultierenden zwei Sublayer wurden unter einem Sezierendes Mikroskop beobachtet. IPL ist durchscheinend, während OPL dicht, bewölkt und weißlich ist.
Nach der Trennung wurden OPL und IPL unabhängig lyophilisiert und ihr Proteingehalt wurde durch eine Kombination aus mechanischem Schleifen, einem anionischen Reinigungsmittel, einem Reduktionsmittel und Kochen vollständig aufgelöst. Die Proben zeigten unterschiedliche elektrophoretische Profile auf einem Polyacrylamid-Gel. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass die Trennung der Sublayer ein kritischer Schritt des Verfahrens ist und mit einem binokularen Mikroskop in einem Puffer durchgeführt werden muss, der eine minimale Salzkonzentration enthält.
Um ihre jeweilige physiologische Funktion weiter aufzuklären, können die Perivitelline-Membran-Sublayer-Proben mittels elektronischer Mikroskopie und für Funktionsstudien mit bildgebenden Assays und Zellmigration auf histologische Charakterisierung analysiert werden.
