Мышиные первичные гепатоциты играют важную роль в исследованиях печени. Особенно для метаболизма глюкозы и печеночного лекарственного тестирования. С точки зрения времени процесс изоляции может быть трудоемким, а энергия дорогостоящей.
Этот протокол может обеспечить эффективный способ выделения первичных гепатоцитов мыши. Это дружественно по времени и труду. Требуется очень мало шагов со всеми регионами, коммерчески доступными.
Начните с использования перистальтического насоса, чтобы начать откачку разогретой двойной дистиллированной воды со скоростью 4 мл в минуту, в течение пяти минут. Затем замените насосную трубку с воды на нагретую перфузионную среду. Мониторинг пузырьков воздуха между водой и перфузионной средой.
Поможет отследить протекание перфузионной среды через систему. Затем продезинфицируйте брюшко анестезированной восьминедельной C57 черной 6J женской мыши с 70% этанолом. И с помощью ножниц разрезайте брюшную полость, чтобы обнажить печень, воротную вену и нижнюю полую вену.
Затем остановите перистальтический насос. После убедитесь, что насосная трубка содержит перфузионную среду, а не воду. Вставьте катетер 24 калибра в нижнюю полую вену.
Снова включите насос и разрежьте портальную жилу. Пока перфузионная среда перекачивается, нажимайте на воротную вену каждую минуту, чтобы жидкость достигла каждого уголка печени. Продолжайте откачку в течение примерно трех-пяти минут или до тех пор, пока смытая жидкость не станет прозрачной.
Затем замените насосную трубку с перфузионной среды на среду диспазы коллагеназы. И нажимайте на воротную вену каждую минуту, чтобы жидкость достигла каждого уголка печени. Продолжайте сцеживание до тех пор, пока не истощатся все 25 мл среды диспазы коллагеназы.
Далее выделяют всю печень без желчного пузыря. И поместили его в 30 мл промывочной среды в чашку Петри на льду. С помощью щипцов разорвите печень на куски, чтобы выпустить первичные гепатоциты в раствор.
На этом этапе промывная среда превращается в мутный раствор, содержащий высвобожденные первичные гепатоциты и мелкие кусочки печени. Отфильтруйте этот мутный раствор через 70-микронный клеточный ситечко в 20 мл 1X на вызов HBSS в трубке объемом 50 мл на льду. И перемешать раствор, перевернув трубку 20 раз.
Далее центрифугируют раствор. Затем в тканевом культуральном капюшоне аспирируют супернатант. И промыть гранулу 30 мл холодной промывочной среды.
Гранулируйте клетки еще раз центрифугированием. Удалите надосадочное вещество и повторно суспендируйте гранулы в 25 мл питательной среды. Подсчитайте клетки и нанесите их на нужные культуральные пластины.
По опытному проекту. После обшивки изолированные первичные гепатоциты прочно прикреплялись на один час и полностью расширялись через 12 часов. В изолированных гепатоцитах уровни мРНК маркеров гепатоцитов, таких как транстиретин, CD95, ASGR1 и ASGR2, были значительно увеличены по сравнению со всей печенью.
Напротив, присутствие иммунных клеток, звездчатых клеток и эндотелиальных клеток было ниже. О чем свидетельствует резкое снижение уровня CD45, коллагена 1 типа альфа 1 и эндотелиальной клетки 2 киназы 2 мРНК. Предполагая, что этот протокол может значительно уменьшить помехи от других печеночных клеток.
После нанесения покрытий уровни ASGR1 и ASGR2 со временем снижались, но оставались сопоставимыми со всей печенью до 12-часовой временной точки. Особенно для ASGR1. Уровень экспрессии cd81, связанного с мембраной, был постоянным в течение 48 часов.
Для сравнения, экспрессия толл-подобного рецептора 4 обычно увеличивалась и становилась выше, чем уровни in vivo через 48 часов. Анализы чувствительности к инсулину показали, что инсулин значительно способствует фосфорилированию обоих АКТ при серине 473. И вилочная коробка 01 при серине 256, в гепатоцитах.
Указывает на чувствительность первичных гепатоцитов к инсулину. Уровень белка фосфоенолпируваткароксикиназы значительно повысился после лечения глюкагоном. Предполагая, что путь производства глюкозы был активирован.
Эта активация была дополнительно подтверждена увеличением производства глюкозы. И с другими стимуляторами производства глюкозы, такими как Forskolin + IBMX. Этот протокол может сэкономить как время, так и энергию для исследований с использованием мышиных первичных гепатоцитов.
Следуя этому протоколу, могут быть проведены связанные эксперименты, такие как гипотетический метаболизм глюкозы и фармацевтические анализы биомаркеров.
