Hepatócitos primários do rato são importantes em estudos hepáticos. Especialmente para o metabolismo da glicose, e testes de drogas hepáticas. Tempo sábio o processo de isolamento pode ser demorado e a energia cara.
Este protocolo pode fornecer uma maneira eficiente de isolar hepatócitos primários do mouse. É tempo e trabalho amigável. Exigindo pouquíssimas etapas com todas as regiões disponíveis comercialmente.
Comece usando a bomba peristáltica para começar a bombear água destilada dupla a uma velocidade de 4 mL por minuto, durante cinco minutos. Em seguida, troque o tubo de bombeamento da água para o meio de perfusão aquecido. Monitorando a bolha de ar entre a água e o meio de perfusão.
Ajudará a rastrear o fluxo do meio de perfusão através do sistema. Em seguida, desinfete o abdômen de um rato fêmea C57 preto 6J de oito semanas com 70% de etanol. E usando uma tesoura, abra o abdômen para expor o fígado, a veia portal e a veia inferior.
Então pare a bomba peristáltica. Depois de garantir que o tubo de bombeamento contenha meio de perfusão e não água. Insira um cateter de calibre 24 na cava vena inferior.
Ligue a bomba e corte a veia do portal aberta. Enquanto o meio de perfusão está sendo bombeado, pressione a veia portal a cada minuto para deixar o líquido alcançar cada canto do fígado. Continue bombeando por aproximadamente três a cinco minutos ou até que o líquido liberado esteja limpo.
Em seguida, altere o tubo de bombeamento do meio de perfusão para o meio de despase colagenase. E pressione a veia do portal a cada minuto para deixar o líquido alcançar cada canto do fígado. Continue bombeando até que todos os 25 mL do meio de despastê colagenase estejam esgotados.
Em seguida, isole todo o fígado sem a vesícula biliar. E colocou-o em 30 mL de meio de lavagem em uma placa de Petri no gelo. Usando fórceps rasgam o fígado em pedaços para liberar hepatócitos primários na solução.
Nesta fase, o meio de lavagem se transforma em uma solução nublada contendo hepatócitos primários liberados e pequenos pedaços de fígado. Filtre esta solução nublada através de um filtro de células de 70 mn, em 20 mL de 1X por chamada HBSS em um tubo de 50 mL no gelo. E misture a solução invertendo o tubo 20 vezes.
Em seguida, centrifugar a solução. Então, na capa da cultura do tecido, aspire o supernante. E lave a pelota com 30 mL de meio de lavagem a frio.
Pelota as células mais uma vez com centrifugação. Remova o supernasce e suspenda a pelota em 25 mL de meio de cultura. Conte as células e emplaque-as em placas de cultura desejadas.
De acordo com o projeto experimental. Após o revestimento, hepatócitos primários isolados foram firmemente ligados por uma hora e totalmente expandidos após 12 horas. Nos hepatócitos isolados, os níveis de mRNA de marcadores hepatócitos, como transtíretina, CD95, ASGR1 e ASGR2 foram significativamente aumentados em comparação com todo o fígado.
Em contraste, a presença de células imunes, células estelares e células endoteliais foi menor. Como evidenciado por uma redução acentuada nos níveis de CD45, colágeno tipo 1 alfa 1, e célula endotelial 2 níveis de quinase 2 mRNA. Sugerindo que este protocolo pode reduzir muito a interferência de outras células hepáticas.
Após o revestimento dos níveis ASGR1 e ASGR2 diminuiu com o tempo, mas permanece comparável a todo o fígado até o ponto de tempo de 12 horas. Especialmente para ASGR1. O nível de expressão da membrana ligada ao CD81 foi consistente por até 48 horas.
Em comparação, a expressão do receptor 4 em número de pedágio aumentou e tornou-se mais alta do que os níveis in vivo após 48 horas. Ensaios de sensibilidade à insulina demonstraram que a insulina promoveu significativamente a fosforilação de ambos os AKT em serina 473. E caixa de garfo 01 no Serine 256, nos hepatócitos.
Indicando a sensibilidade dos hepatócitos primários à insulina. Os níveis de proteína de phosphoenolpyruvate carboxykinase aumentaram significativamente após o tratamento de glucagon. Sugerindo que a via de produção de glicose foi ativada.
Essa ativação foi confirmada ainda pelo aumento da produção de glicose. E com outros estimuladores de produção de glicose como Forskolin+IBMX. Este protocolo pode economizar tempo e energia para estudos usando hepatócitos primários do rato.
Seguindo este protocolo, podem ser realizados experimentos relacionados, como o hipotético metabolismo de glicose e ensaios biomarcadores farmacêuticos.
