Fare primer hepatositleri karaciğer çalışmalarında önemlidir. Özellikle glikoz metabolizması ve hepatik ilaç testi için. Zaman açısından izolasyon işlemi zaman alıcı ve enerji maliyetli olabilir.
Bu protokol, fare primer hepatositlerini izole etmek için etkili bir yol sağlayabilir. Zaman ve emek dostudur. Ticari olarak temin edilebilen tüm bölgelerle çok az adım gerektirir.
Isıtılmış çift damıtılmış suyu dakikada 4 mL hızda, beş dakika boyunca pompalamaya başlamak için peristaltik pompayı kullanarak başlayın. Ardından pompalama tüpünü sudan ısıtılmış perfüzyon ortamına değiştirin. Su ve perfüzyon ortamı arasındaki hava kabarcığının izlenmesi.
Perfüzyon ortamının sistemdeki akışını izlemeye yardımcı olacaktır. Daha sonra anestezi uygulanan sekiz haftalık C57 siyah 6J dişi farenin karnını% 70 etanol ile dezenfekte edin. Ve bir makas kullanarak, karaciğeri, portal veni ve inferior vena kavayı açığa çıkarmak için karnı kesin.
Ardından peristaltik pompayı durdurun. Pompalama borusunun su değil perfüzyon ortamı içerdiğinden emin olduktan sonra. İnferior vena kavaya 24 gauge kateter yerleştirin.
Pompayı tekrar açın ve portal damarı kesin. Perfüzyon ortamı pompalanırken, sıvının karaciğerin her köşesine ulaşmasına izin vermek için portal damara her dakika basın. Yaklaşık üç ila beş dakika boyunca veya yıkanan sıvı temizlenene kadar pompalamaya devam edin.
Daha sonra pompalama tüpünü perfüzyon ortamından kollajenaz dispase ortamına değiştirin. Ve sıvının karaciğerin her köşesine ulaşmasına izin vermek için portal damara her dakika basın. Kollajenaz dispase ortamının 25 mL'sinin tamamı tükenene kadar pompalamaya devam edin.
Daha sonra safra kesesi olmadan tüm karaciğeri izole edin. Ve buz üzerinde bir Petri kabında 30 mL yıkama ortamına yerleştirin. Forseps kullanmak, primer hepatositleri çözeltiye salmak için karaciğeri parçalara ayırır.
Bu aşamada, yıkama ortamı, serbest bırakılan birincil hepatositleri ve küçük karaciğer parçalarını içeren bulutlu bir çözeltiye dönüşür. Bu bulutlu çözeltiyi 70 mikronluk bir hücre süzgeciyle, buz üzerinde 50 mL'lik bir tüpte HBSS çağrısı başına 20 mL 1X'e filtreleyin. Ve tüpü 20 kez ters çevirerek çözeltiyi karıştırın.
Daha sonra çözümü santrifüj edin. Daha sonra doku kültürü başlığında, süpernatanı aspire edin. Peleti 30 mL soğuk yıkama ortamı ile yıkayın.
Santrifüjleme ile hücreleri bir kez daha pelet edin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 25 mL kültür ortamında tekrar askıya alın. Hücreleri sayın ve istediğiniz kültür plakalarına yerleştirin.
Deneysel tasarıma göre. Kaplamadan sonra, izole edilmiş primer hepatositler bir saat sıkıca tutturuldu ve 12 saat sonra tamamen genişletildi. İzole hepatositlerde, transtiretin, CD95, ASGR1 ve ASGR2 gibi hepatosit belirteçlerinin mRNA düzeyleri tüm karaciğere kıyasla anlamlı derecede artmıştır.
Buna karşılık, bağışıklık hücrelerinin, yıldız hücrelerinin ve endotel hücrelerinin varlığı daha düşüktü. CD45, kollajen tip 1 alfa 1 ve endotel hücresi 2 kinaz 2 mRNA seviyelerinde keskin bir azalma ile kanıtlandığı gibi. Bu protokolün diğer hepatik hücrelerden gelen paraziti büyük ölçüde azaltabileceğini düşündürmektedir.
Kaplamadan sonra ASGR1 ve ASGR2 seviyeleri zamanla azaldı, ancak 12 saatlik zaman noktasına kadar tüm karaciğerle karşılaştırılabilir kaldı. Özellikle ASGR1 için. Membrana bağlı CD81'in ekspresyon seviyesi 48 saate kadar tutarlıydı.
Buna karşılık, toll-like reseptör 4 ekspresyonu genellikle artmış ve 48 saat sonra in vivo seviyelerden daha yüksek hale gelmiştir. İnsülin duyarlılık testleri, insülinin serin 473'te her iki AKT'nin fosforilasyonunu önemli ölçüde desteklediğini göstermiştir. Ve hepatositlerde serin 256'da çatal kafalı kutu 01.
Primer hepatositlerin insüline duyarlılığını gösterir. Fosfoenolpiruvat karboksikinaz protein seviyeleri glukagon tedavisinden sonra anlamlı derecede artmıştır. Glikoz üretim yolunun aktive edildiğini düşündürmektedir.
Bu aktivasyon, artan glikoz üretimi ile daha da doğrulandı. Ve Forskolin + IBMX gibi diğer glikoz üretim uyarıcıları ile. Bu protokol, fare primer hepatositlerini kullanan çalışmalar için hem zamandan hem de enerjiden tasarruf sağlayabilir.
Bu protokolü takiben, varsayımsal glikoz metabolizması ve farmasötik biyobelirteç testleri gibi ilgili deneyler yapılabilir.
