Представлен протокол электронно-микроскопической визуализации репликативных доменов в клетке путем маркировки EdU вновь синтезированной ДНК и обнаружения меток с серебристым усилением частиц Nanogold и окрашиванием хроматина ChromEM. Этот протокол обеспечивает высококонтрастную маркировку предварительного встраивания с традиционной фиксацией глутаральдегида, которая обеспечивает наилучшую структурную сохранность хроматина для обработки образцов комнатной температуры. Этот протокол оптимизирован для клетки адгезии, растущей на покровах в чашке Петри.
Добавьте EdU до конечной концентрации 10 микромолей и поместите клетки в инкубатор на желаемое время маркировки. Зафиксируйте меченые клетки 2,5%-ным глуарадегидратом в 100-миллиметровом растворе какодилата натрия в течение одного часа. Более длительное время фиксации может негативно повлиять на маркировку EdU.
Удалите глутаровый альдегид, промыв образцы PBS, дополненным пятью миллимолями хлорида магния, который также считается звездой PBS. Вымойте три раза в течение 10 минут. Пермеабилизируйте плазматические мембраны 1% раствором Trione X-100 в звезде PBS, внесите два изменения в течение пяти минут каждое.
Это решение далее называют звездой PBS T.Широко промывайте образец звездой PBS. Пять изменений за пять минут каждое. Гасите остаточные альдегидные группы 20 миллимолями глицина в звезде PBS два раза в течение 10 минут.
Поместите образец в звезду PBS с 1% BSA на полчаса. Во время блокировки в BSA приготовьте реакционный коктейль для обнаружения EdU. Важен порядок добавления компонентов.
Конъюгация биотин-азида EdU выполняется во влажной камере для минимизации испарения и сдвигов концентрации в реакционном коктейле. Подготовьте влажную камеру. Поместите крышку на парапленку с ячейками, обращенными вверх, и наложите от 50 до 100 микролитров реакционного коктейля на крышку.
Реакция занимает 30 минут при комнатной температуре. Остановите реакцию, промыв образец в звезде PBS T, пять раз в течение пяти минут каждый. Снова блокируйте с 1% BSA в PBS star T еще на полчаса.
Готовят раствор стрептавидина-нанозолоты в PBS star T с 1% BSA. Инкубируйте образец стрептавидином в течение ночи при плюс четырех градусах во вновь подготовленной влажной камере. Процедура такая же, как и при конъюгации биотин-азида EdU.
Остановить реакцию и промыть образец, пять раз по 10 минут каждый со звездой PBS T. Стабилизировать комплекс стрептавидина биотина путем дополнительной фиксации будет 1%глутаральдегида PBS звезды в течение получаса. Удалите глутаровый альдегид путем интенсивного промывания деионизированной водой. Закалка остаточных альдегидных групп одним миллиграммом на миллилитр боргидрида натрия.
Снова тщательно вымойте. Следующим шагом является увеличение размера частиц Nanogold путем осаждения серебра на золотом курсе. Подготовьте премиксы, чтобы свести к минимуму активность в темной комнате.
Уравновесьте образцы с помощью промывочного буфера и перейдите в темную комнату. В темной комнате смешайте компоненты для приготовления моющего раствора и нанесите его на образцы. Раствор порошка акации имеет высокую вязкость.
Поэтому во время смешивания компонентов медленно раскачивайте трубку, чтобы избежать образования пузырьков и пены. Реакция занимает от двух до пяти минут. Мы рекомендуем выполнить тестовый запуск, чтобы определить оптимальное время реакции.
Более длительное время инкубации может привести к неспецифическому осаждению серебра. Чтобы остановить реакцию, быстро промойте образец с тремя-пятью изменениями деионизированной воды. Затем последовали еще три изменения по пять минут каждое.
Чтобы защитить наночастицы серебра от растворения тетроксидом осмия, инкубируйте образцы в 0,05% тетрахлорауровой кислоты в течение двух минут в темноте. Тщательно промойте деионизированной водой. На этом этапе к МАТЕРИАЛУ, содержащему ДНК, добавляется дополнительный контраст.
Насытите образец пятном ДНК DRAQ5. Добавьте к образцу раствор диамионобензидина и инкубируйте в течение одной минуты. Переместите крышку в стеклянную нижнюю чашку Петри, и поместите ее на сцену перевернутого микроскопа.
Облучите несколько полей зрения 640-нанометровым красным светом. Левая панель показывает полную фотографию отбеливания DRAQ5. На правой панели то же поле зрения изображено в проходящем свете, показывающем осадок DAB.
Промывайте образцы деионизированной водой. Следующий этап следует выполнять под вытяжным капотом. Готовят частично восстановленный раствор тетроксида осмия.
Будь осторожен. Это вещество является высоколетучим и токсичным. Нанесите приготовленный раствор на образец.
На этой стадии восстановленные соединения осмия реагируют с отложениями диамионобензидина и повышают контраст ДНК. Утилизируйте раствор, содержащий осмий, в соответствии с местными правилами и промывайте образцы три раза в течение пяти минут каждый. Образец дополнительно обезвоживается в серии увеличивающихся концентраций этанола с последующей инфильтрацией клеток смесями этаноловой смолы.
Замените смесь спиртовой смолы свежеприготовленной чистой смолой. Наполните форму для встраивания подходящего размера свежеприготовленной смолой. Поместите крышку с ячейками, обращенными вниз над заполненной смолой полостью.
Отверждайте смолу в течение 24 часов при 37 градусах. Затем при 60 градусах не менее двух дней. Удалите смолу с нижней поверхности крышки.
Опустите плиту в жидкий азот, а затем переложите в кипящую воду. Стекло должно отсоединиться. При необходимости повторите.
Облученные поля зрения должны быть хорошо видны благодаря осаждению диамионобензидина и окрашиванию DAB. Вырежьте интересующую область из плиты с помощью ножовки или любого другого подходящего инструмента. Поместите вырез в ультрамикротомный простой держатель.
Настройте ультрамикротом для окончательной обрезки блоков. Используя лезвие бритвы, приготовьте пиллет в форме пирамиды. Размер плоской площади на вершине пирамиды должен составлять около 400 на 200 мкм.
Установите подготовленную пирамиду в ультрамикротомную руку и установите нож. Подготовьте разделы. Толщина секции может быть отрегулирована в соответствии с экспериментальными требованиями.
Мы стремимся к ЭМ-томографии. Поэтому мы подготовили секции толщиной 250 нанометров, также называемые полутонкими секциями. Отсоедините секции от края ножа и установите их на щелевую сетку.
Мы использовали щелевую сетку, они были круглыми на один миллиметр, чтобы быть вокруг, один миллиметр боковым отверстием. Небольшой размер отверстия обеспечивает лучшую устойчивость секций. Дайте образцам высохнуть на сетке.
На данный момент участки готовы к наблюдению. Поместите сетку в держатель образца электронного микроскопа. Загрузите образец в электронный микроскоп.
Приобретайте наклонные серии. Очаги репликации в ядрах клеток млекопитающих демонстрируют отчетливые закономерности распределения в зависимости от прогрессирования S-фазы. Успешная маркировка EdU, подтвержденная реакцией щелчка с флуоресцентно меченым азидом, демонстрирует типичную картину репликации в гетерогенной клеточной популяции после фиксации глутаральдегида сверху.
На маркировку стрептавидина может влиять глутаровый альдегид. Поэтому сначала проверьте флуоресцентное окрашивание стрептавидином в том же состоянии, что и нанозолото стрептавидина на дне. Хорошим результатом процедуры увеличения серебра является темно-коричневое окрашивание некоторых ядер и очень слабое желтое пятно цитопласта, показанное на дне.
Преимуществом предвстраиваемой маркировки является возможность выбора ячеек для секционирования. Это возможно на этом этапе, потому что паттерны маркировки становятся видимыми под ярким полевым микроскопом. Соответствующая маркировка приводит к хорошо разграниченным участкам репликации.
Наконечник стрелы показывает окрашенные DAB волокна хроматина. Фоновая маркировка справа ограничена несколькими наночастицами на квадратный микрон. Полутонкие срезы готовы к томографии и не требуют добавления наночастиц золота.
Описанный подход используется для исследований организации хроматина на участках с включенной репликацией. Для анализа пострепликативной перестройки хроматина, включая визуализацию сегрегации хроматина с высоким разрешением. Он также используется для реплицированной маркировки крупных хромосомных доменов и исследований складчатости хроматина высшего порядка и гетерохроматина.
Этот метод визуализации также важен в качестве ориентира для данных, генерируемых другими немикроскопическими подходами. Метод также может быть включен в коррелированные микроскопические исследования, включая методы сверхвысокого разрешения. Это открывает новые горизонты в исследованиях структуры хроматина высшего порядка и его динамики в различных физиологических состояниях клетки.
