Этот протокол описывает подготовку и использование куриных эмбрионов между пятым и восьмым днем инкубации для ультразвуковой визуализации с усилением контраста и исследований доставки лекарств, опосредованных микропузырем Три метода извлечения содержимого из яичной скорлупы на пятый-восьмой день позволяют его развитие в скорлупе и требуют только основных лабораторных инструментов. Эта модель подходит для изучения различных аспектов ультразвуковых и сосудистых исследований, таких как визуализация кровотока, доставка лекарств и новые ультразвуковые контрастные вещества и преобразователи. Чтобы подготовить пятидневный эмбрион, поместите пятидневную инкубированную оплодотворенную яйцеклетку в предварительно подогретый держатель яиц с яйцеклеткой в той же ориентации, что и в инкубаторе, и используйте заостренную заднюю часть кончика пинцета, чтобы сделать небольшой углубление на самой верхней части яйца.
Используйте пинцет, чтобы сделать второй углубление на стороне яйца примерно на 2/3 вниз по длине яйца и используйте пару более крупных пинцетов, чтобы удалить небольшой кусочек яичной скорлупы из вдавленной области в верхней части яйца, заботясь о том, чтобы воздушный мешок контактировал с окружающим воздухом, не проникая в скорлупу слишком глубоко. С помощью пятимиллилитрового шприца, оснащенного иглой 19-го калибра, проникают в оболочку через второй углубление иглой, направленной вниз, и выводят примерно два миллилитра альбумина. Когда альбумин будет собран, используйте ленту, чтобы запечатать прокол и распределить альбумин в весовую лодку.
Используйте большой пинцет, чтобы увеличить небольшое отверстие в верхней части яйца до тех пор, пока эмбрион и хориоаллантоическая мембрана не будут полностью видны, не удаляя оболочку ниже хориоаллантоической мембраны или не проникая во внутреннюю мембрану. Когда будет создано достаточное отверстие, поверните яйцо на 180 градусов внутри держателя так, чтобы отверстие в верхней части яйца теперь было обращено к низу. Через одну-две минуты эмбрион всплывет вверх, став невидимым со дна.
Когда весь эмбрион и хориоаллантоическая оболочка исчезнут из поля зрения и будет виден только желток, снимите ленту с бокового отверстия. Внутренняя часть яйца должна выпячиваться из отверстия. Удерживая дно яйца близко к весовой лодке в металлическом держателе весовой лодки, используйте острые точки небольших пинцетов, чтобы мягко, но быстро сделать горизонтальную царапину в мембране по всей ширине отверстия и осторожно опустить содержимое яйца в весовую лодку.
Проверьте, присутствует ли сердцебиение, чтобы подтвердить, что эмбрион все еще жив, сосуды хориоаллантоической мембраны неповреждены, и нет утечки крови или желтка. Поместите жизнеспособный эмбрион при температуре 37 градусов Цельсия с регулярным введением 30-микролитровых капель PBS 37 градусов Цельсия в эмбрион и хориоаллантоидальную мембрану. Чтобы собрать шести-семидневный эмбрион и хориоаллантоическую мембрану, подготовьте яйцо, как показано для пятидневного эмбриона, и используйте новый пятимиллилитровой шприц, оснащенный иглой 19-го калибра, чтобы проникнуть в скорлупу через второе углубление с иглой, направленной вниз, чтобы вывести пять-шесть миллилитров альбумина за одно проникновение.
Когда альбумин будет собран, вставьте иглу 10-миллилитрового шприца, содержащего примерно один миллилитр 37 градусов Цельсия PBS, больше, чем изъятый объем, в боковую часть оболочки с иглой, направленной вниз, чтобы заменить собранный альбумин. Затем быстро запечатайте зазор куском ленты и закончите обработку яйца, как показано. Чтобы собрать эмбрион и хориоаллантоидную мембрану из восьмидневной оплодотворенной яйцеклетки, держите яйцо горизонтально, используйте задний конец пары больших пинцетов и сделайте небольшой углубление примерно на полпути вниз по длине яйца.
Сделайте небольшие углубления в виде кольцевого рисунка на 360 градусов вокруг пространства скорлупы яйца примерно на расстоянии 10 миллиметров друг от друга. Когда все отступы будут созданы, используйте заостренный конец пинцета, чтобы расколоть скорлупу между двумя углублениями и полностью погрузить яйцо в 37-градусный PBS по Цельсию на пять минут. В конце инкубации переместите яйцо над весовой лодкой в PBS и поместите оба больших пальца в большое отверстие, чтобы осторожно открыть яйцо, которое должно треснуть вдоль небольших углублений.
Когда вокруг яичной скорлупы образуется трещина, осторожно раздвиньте две стороны, осторожно перемещая кусочки вперед и назад, пока содержимое яйца не отделится от скорлупы, и опустите содержимое в весовую лодку. Медленно поднимите весовую лодку, содержащую яичное содержимое из PBS, слегка наклонив путь лодки, чтобы удалить излишки PBS. Затем поместите весовую лодку в металлический держатель для взвешивания.
На этом этапе у эмбриона можно увидеть бьющееся сердце. Чтобы подготовить образец эмбриона и хориоаллантоической мембраны для микроскопической визуализации, поместите держатель с акустической мембраной с агарозой на дно однопометной чашки Петри, содержащей примерно 500 миллилитров 37-градусного Цельсия PBS с агарозным слоем, обращенным вверх. Используйте небольшие ножницы, чтобы быстро врезаться в мембрану вителлуса в шесть-семь разрезов вокруг всей хориоаллантоической мембраны, вращая весовую лодку для лучшей точности и скорости.
Используйте столовую ложку, чтобы зачерпнуть вырезанную мембрану, содержащую эмбрион и хориоаллантоидную мембрану, и медленно поднимите ложку, чтобы обеспечить визуальный осмотр того, прикреплена ли вырезанная мембрана, содержащая эмбрион и хориоаллантоидную мембрану, к остальной части мембраны желточного мешка. Слегка наклоните ложку, чтобы избавиться от как можно большего количества желтка, не пересушивая ткань и погружайте вырезанную мембрану в PBS в литровую чашку Петри. Используя небольшой пинцет, захватите и осторожно закрутите один край мембраны, чтобы удалить любой желток, который все еще прикреплен, прежде чем перемещать мембрану над держателем с акустической мембраной.
Используйте штифт образца насекомого, чтобы закрепить мембрану на противоположных углах держателя и избежать прокалывания сосудов хориоаллантоидной мембраны. Когда оба угла будут закреплены, поднимите и слегка наклоните держатель, чтобы отбросить большую часть PBS, и используйте небольшой пинцет, чтобы растянуть и равномерно распределить мембрану по держателю, чтобы остальная часть мембраны была прикреплена к держателю. Когда эмбрион будет закреплен, поместите держателя в микроскопическую установку при температуре 37 градусов цельсия и поместите акустически и оптически прозрачную мембрану над областью интереса на образце, чтобы обеспечить оптическую визуализацию сосудов.
В этом репрезентативном анализе пять, шесть, семь и восемь дней эмбрионы и хориоаллантоидные мембраны были удалены, как показано. Не наблюдается кровотечения или повреждения эмбрионов или хориоаллантоических мембран, что указывает на то, что эти методы могут быть использованы для безопасного сбора содержимого яиц без вреда для эмбриона или сосудов хориоаллантоической мембраны. Во время экстракции могут возникнуть множественные осложнения, поэтому важно тщательно соблюдать протокол и выбрасывать любые поврежденные образцы тканей.
Как показано, эмбриону можно вводить, например, ультразвуковые контрастные вещества, такие как микропузырьки. При родах можно наблюдать, как микропузырьки циркулируют в просвете вводимого кровеносного сосуда и циркулируют в периферической крови в течение нескольких часов. До микропузырьковой инъекции контраст уже можно наблюдать внутри эмбрионального сердца в режиме В, но не высокочастотную ультразвуковую субгармоническую визуализацию.
Добавление микропузырьков увеличивает контрастность и видимость эмбриона в обоих типах изображений. Высокочастотные 3D субгармонические изображения также могут быть получены после инъекции контрастного вещества для визуализации сосудистых сетей внутри эмбриона и хориоаллантойной мембраны. Куриный эмбрион и сосуды хориоаллантоидной мембраны также могут быть использованы для исследования доставки лекарств, опосредованных ультразвуком.
При попытке этой процедуры наиболее важно всегда держать эмбрион и CAM на уровне 37 градусов по Цельсию и не давать ему высохнуть. После этой процедуры куриный эмбрион может быть помещен в различные установки, такие как резервуар для воды или микроскоп для выполнения контрастной усиленной ультразвуковой визуализации или исследований доставки лекарств, опосредованных микропузырем. Этот метод и препарат подходит для ультразвуковых исследований контрастных веществ, а также может быть использован для исследования рака и вирусов.
