Экспланты, полученные от пациента, являются краткосрочным методом, обеспечивающим немедленные данные о реакции на лекарства, которые могут точно прогнозировать результаты лечения пациентов. Платформы PD позволяют исследовать лекарственные реакции в 3D-контексте, который максимально точно отражает патологические и архитектурные особенности регионарных опухолей. Экспланты могут предложить новое понимание метаболизма и механизма действия лекарственного средства и облегчить идентификацию новых фармакодинамических биомаркеров.
Перед началом эксперимента очистите все хирургическое оборудование 70% раствором промышленных метилированных спиртов. Наполните 10-сантиметровое культуральное блюдо 25 миллилитрами свежей среды на льду. Используя пинцет, перенесите образец на поверхность зубного воска и используйте два лезвия кожного трансплантата, чтобы разрезать ткань на фрагменты размером примерно два-три кубических миллиметра.
Переложите экспланты в 10-сантиметровую посуду и поместите шесть-девять кусочков ткани в одну миллилитровую трубку, содержащую 10% небуферизованный раствор формалина для 24-часовой инкубации при комнатной температуре. Заполните нужное количество лунок шестилуночной плиты 1,5 миллилитрами свежей среды на скважину. И поместите в каждый колодец органотипическую культурную тарелку, чтобы она плавала поверх среды.
Поместите от шести до девяти эксплантов на каждый вставной диск и храните в течение 16 часов в инкубаторе 5% углекислого газа, чтобы обеспечить восстановление. На следующий день добавьте свежую среду и препарат в каждую лунку новой тарелки. Включите колодец для управления транспортным средством.
Когда все лекарственные средства будут приготовлены, используйте пинцет для переноса одной вставки в каждую лунку новой пластины из шести лунок для инкубации от 24 до 48 часов в инкубаторе углекислого газа. После лечения препаратом перекладывают диски в новые шесть луночных пластин, содержащих 10% формалина. И добавьте несколько капель 10% формалина в верхнюю часть каждого экспланта, чтобы обеспечить полное покрытие фиксатором в течение 24 часов инкубации при комнатной температуре.
На следующий день замочите соответствующее количество небольших гистологических губок в 70% промышленном метилированном растворе. И поместите губки внутрь гистологических кассет. Когда все губки будут помещены, переместите все экспланты из того же состояния лечения лекарством на одну губку с обработанной препаратом стороной каждой эксплантации, контактирующей с вставленным диском.
Поместите еще одну предварительно замоченную губку поверх каждого экспланта и закройте кассету, чтобы закрепить экспланты в кассете. Затем погружают кассеты в 70% промышленный метилированный раствор, прежде чем приступать к гистологической обработке. После сканирования выполните обучающий анализ и загрузите сканы, содержащие штампы для обучения, в соответствующее программное обеспечение для анализа.
В однорежимном представлении перемещайтесь по изображениям и выбирайте сканы для анализа и сканирования с внутренней флуоресценцией. При внутреннем флуоресцентном сканировании в одном представлении щелкните автофлуоресцентный выбор, чтобы нарисовать сегмент на участке незапятнанной ткани. Щелкните Изменить маркеры и цвета и введите имена маркеров в поле, связанном с каждым флуорофором.
Нажмите кнопку Подготовить изображения, чтобы позволить программному обеспечению вычесть интенсивность внутренней флуоресценции из всех загруженных изображений. Щелкните шаг сегмента ткани в верхней части экрана, чтобы открыть окно тренировки сегментации тканей. На панели «Категории тканей» введите название каждой категории тканей, подлежащей сегментации.
Нажмите кнопку Нарисовать, чтобы нарисовать области вокруг групп клеток в интересующей категории тканей. Затем переключитесь на следующую категорию тканей и нарисуйте новые области. Когда все области обучения будут определены, используйте сегментатор тканей тренировки и подождите, пока точность обучения установится.
Возможно до значения, близкого к 100%Нажмите сегментировать все, чтобы сегментировать ткани. После проверки качества сегментации тканей щелкните сегментацию клеток и выберите клеточные компартменты для сегментации. Чтобы настроить ядерный компонент, используйте ползунок типичной интенсивности для настройки порогового значения, используемого для обнаружения ядерных пикселей.
Обратная связь в реальном времени предоставляется окном предварительного просмотра. Чтобы разделить кластеры ядерных пикселей, на панели разделения ядерных компонентов выберите кнопку, которая лучше всего описывает качество окрашивания ядер, и используйте ползунок для настройки чувствительности к расщеплению. Затем щелкните Сегментировать все, чтобы сегментировать все изображения.
Когда все изображения будут сегментированы, на панели фенотипов добавьте список фенотипов, которые необходимо обнаружить, и введите имя фенотипов в соответствующее текстовое поле. Нажмите редактировать фенотипы, чтобы выбрать определенную ячейку и выбрать соответствующий фенотип в раскрывающемся меню. После завершения отбора для обучения нажмите на классификатор поездов, чтобы оценить результат каждого фенотипа.
Перейдите к фенотипу всех, сохраните проект и нажмите экспорт. Выберите вкладку пакетного анализа и загрузите проект в пакетный алгоритм или поле проекта. Чтобы экспортировать изображения и таблицы, выберите все поля в параметрах экспорта, нажмите кнопку Добавить слайды и загрузите все изображения, содержащие штампы для ранее подготовленных пакетов.
Затем нажмите кнопку «Запустить», чтобы начать пакетный анализ одного штампа и экспортировать соответствующие данные, когда они были получены. Мультиспектральная визуализация эксплантной ткани НМРЛ, окрашенной для маркеров жизнеспособности клеток, позволяет идентифицировать и фенотипировать отдельные клеточные популяции, а также идентифицировать опухолевые и стромальные компоненты в микросреде экстраплантной опухоли. Тканевая и клеточная сегментация пятен маркера жизнеспособности клеток мультиспектральных изображений, как показано на рисунке, может быть использована для количественной оценки гибели и пролиферации клеток в эксплантатах, полученных пациентами, обработанными препаратами, представляющими интерес.
Например, в этом анализе в образцах тканей из опухолей, обработанных ниволумабом, было идентифицировано большее количество умирающих клеток по сравнению с контрольными образцами опухоли. Кроме того, как показано на рисунке, способность извлекать пространственную информацию из окрашенных рассечений, позволяет рассчитывать межклеточные расстояния. Экспланты также могут быть использованы для обширного пространственного профилирования или массовой цитометрии, что позволяет одновременно профилировать сотни биомаркеров с дополнительным разрешением при сохранении 3D-структуры образца.
ПД могут предсказать эффективность иммунотерапии. Например, можно было бы различать чувствительные или устойчивые случаи к ингибиторам иммунных контрольных точек и исследовать механизмы, лежащие в основе этого различия.
