Создание соответствующих пар моделей IN vivo/In vitro, полученных от пациента, органоидов PDX и PDX для исследований фармакологии рака

Этот протокол может быть использован для создания соответствующей библиотеки парных ксенотрансплантатов, полученных от пациента, или PDX, и соответствующих органоидных линий, полученных от пациента. Преимущество этого метода заключается в том, что его можно использовать для создания органоидов с использованием PDX для скрининга in vitro, что приводит к совпадению пар моделей in vivo / in vitro. Начните с сбора опухолей и обработки ткани, как описано в рукописи текста.

После переваривания тканей пипеткой вверх и вниз с помощью пятимиллилитровой стерильной пластиковой пипетки. Затем добавьте 20 миллилитров AD+ к гомогенату и отфильтруйте его с помощью 100-микрометрового клеточного ситечкового фильтра. Дважды промыть фильтрат AD+, затем переложить его в пластиковую трубку и центрифугировать в 450 раз G в течение пяти минут.

Повторно суспендируете клетки в BME и держите их на льду. Для приготовления органоидной культуры переложите 200 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку шестияменной пластины и инкубируют пластину при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. Добавьте два миллилитра органоидных сред к каждой лунки и сфотографировать репрезентативные капли под микроскопом.

Поддерживайте органоидные культуры при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа со средними изменениями каждые три-четыре дня и прохождением в соотношении один к двум каждые семь дней. После диссоциации органоидов прогоньте их через 70-микрометровый фильтр в пластиковую трубку объемом 50 миллилитров. Подсчитайте органоиды под микроскопом и повторно суспендируйте их в BME на льду для конечной концентрации 5% Добавьте 50 микролитров органоидной суспензии в каждую 384-луночную пластину с жидкостным дозатором для плотности посева 200 CR2110 PDXOs на лунку.

Используйте цифровой дозатор для добавления SN38 в каждую скважину в последовательном разведении. Создайте карту пластин с помощью программного средства цифрового дозатора. Лечение должно включать отрицательный контрольный носитель со 100% жизнеспособностью и положительный контроль пяти микромоляров ставроспорина с 0% жизнеспособностью.

По завершении поместите обработанные препаратом 384-скважинные пластины обратно в инкубатор с 37 градусами Цельсия. При световой микроскопии PDXO CR2110 показывает типичную кистозную морфологию, демонстрирующую сходство между органоидами, полученными из PDX, и органоидами, полученными из пациента, в одних и тех же условиях культивирования. Гистопатологическое исследование с помощью окрашивания H&E показывает, что тканевые структуры и типы клеток PDXO CR2110 аналогичны оригинальному PDX CR2110.

Сравнение геномных профилей PDX и PDXO демонстрирует 94,92% корреляцию экспрессии транскриптома и 97,67% конкордантность мутаций ДНК, что предполагает общее геномное сходство между этой парой моделей. Анализы чувствительности к лекарственным средствам проводились на PDXO CR2110 в 384-скважинных пластинах. PDXO CR2110 был чувствителен к иринотекану и устойчив к цисплатину, что согласуется с результатами лечения PDX.

Подобранная пара моделей in vitro и in vivo может дополнять друг друга для скрининга in vitro и валидации in vivo, улучшая показатель успеха открытия лекарств и потенциально снижая показатели истощения в клинической разработке.