Этот протокол имеет важное значение, поскольку он позволяет количественно определить два белка в той же области мозга. Это позволяет экспериментатору смотреть на активность в молекулярных сигнальных путей в регионах мозга путем анализа кастрюли и фосфопротеинов. Он также может быть использован для анализа белков, которые являются маркерами различных когнитивных явлений.
Мы используем относительно простой метод, такой как иммуногистохимия, чтобы ответить на вопросы, которые обычно требуют более активного участия методов. В том числе изучение активности молекулярных сигнальных путей, изучение соотношения АМРА/НМДА. Используя криостат поддерживается между минус 9 градусов по Цельсию и минус 12 градусов по Цельсию, ломтик ранее изолированных и замороженных крыс мозга в областях, представляющих интерес на 30-50 микрометров.
Непосредственно монтировать ломтики на стеклянные горки и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию до иммуноцитохимии. Удалите стеклянные горки из морозильной камеры и дайте им равноденствия до комнатной температуры в течение 30 минут. Работая под капотом дыма, поместите слайды в 4%paraformaldehyde в 0,1 моляра PBS в течение одного-двух часов при комнатной температуре для фиксации тканей.
Затем промыть слайды в 0,1 молар TBS три раза в течение 10 минут каждый. Чтобы пронизать клеточные мембраны, инкубировать слайды в мягком моющее средство в течение 30-60 минут. И промыть снова в TBS три раза в течение 15 минут каждый.
Разбавить первичное антитело для белка, представляющих интерес в PBS в правильной концентрации, как описано в рукописи. Пипетт первичного раствора антител непосредственно на ткани мозга. Поместите крышку скользит на слайдах и инкубировать ткани мозга в первичном разбавлении антител в течение 1-2 часов при комнатной температуре.
После инкубации, удалить крышку скользит и мыть слайды в TBS, который имеет небольшое количество моющего средства добавил к нему, четыре раза в течение 15 минут каждый. Разбавить вторичные антитела в разбавлении, содержащем TBS, моющее средство, и 1,5% принимающей сыворотки. Добавить вторичное антитело к слайдам, накрыть крышкой скользит и инкубировать при комнатной температуре в течение двух часов.
После инкубации, промыть слайды в TBS-T четыре раза в течение 20 минут каждый, а затем в TBS четыре раза в течение 20 минут каждый. Высушите горки при комнатной температуре в темноте, на ночь. Поместите слайды на интерфейс ближнего инфракрасного сканирования с тканью лицом вниз.
Изображение несколько слайдов одновременно с помощью инструмента выбора. Изображение слайдов с использованием параметра высочайшего качества с разрешением 21 микрометр. В смещении нулевых нанометров, импорт изображения в программное обеспечение анализа изображений для просмотра и отметки для полуколичного анализа белка.
Открыв программное обеспечение для анализа изображений, выберите рабочую область, в которую было отсканировано изображение. Затем откройте отсканированное изображение в программном обеспечении для анализа изображений для просмотра сканирования и регулировки длин волн, контрастности, яркости и увеличения, показанных без изменения необработаного изображения или общего количественного излучения. После определения ключевых областей для количественной оценки выберите вкладку анализа в верхней части страницы, а затем выберите прямоугольник рисовать, чтобы нарисовать прямоугольник над областью, которая будет количественно.
Чтобы просмотреть размер прямоугольника, выберите фигуры в левом нижнем углу экрана. Затем выберите столбцы в правом нижнем углу. Затем добавьте столбцы высоты и ширины, чтобы определить размер формы.
Наконец, назовите форму и повторите. После того, как все регионы будут отобраны, приступить к объединению и анализу данных, доступных из вкладки столбцов. Чтобы убедиться, что этот протокол работает, секции мозга были инкубированы с первичными и вторичными антителами, вторичными антителами в одиночку, или ни первичными, ни вторичными антителами.
Непосредственное раннее экспрессия гена c-jun было обнаружено в спинном гиппокампе и миндалинах только тогда, когда к тканям мозга применялись как первичные, так и вторичные антитела. Подугнуля GluR1 рецептора АМРА и подугнуля рецептора NMDA NR2A были анализированы при обнаружении белка стула в ядрах миндалины. Это позволило изучить соотношение рецепторов AMPA NMDA в подядерах миндалины, которая является нейробиологической подписью обучения и памяти.
Средние и нормализованные показатели экспрессии белка были получены в результате сканирования высокого разрешения в брюшном гиппокампе. Используя программное обеспечение анализа изображений, прямоугольник помещается в области интереса и средняя интенсивность света от формы был использован в качестве меры экспрессии флюорофора, который является мерой экспрессии белка. Для получения нормализованной кривой, форма была помещена через область, которая выражает высокий сигнал и низкий сигнал в области под кривой был использован в качестве меры экспрессии белка.
Самая большая борьба с этой процедурой находит антитела и убедившись, что она работает. Приложение простое. Мой совет был бы сначала попытка регулярной иммуногистохимической процедуры, а затем попробовать эту технику.
Всегда выполняя анализ проверки в первую очередь. Самое главное помнить, чтобы проверить ваши антитела разбавления и убедитесь, что он применяется правильно. Без этих шагов процедура провалится.
