Органоиды являются мощной технологией in vitro, используемой для скрининга лекарств и понимания биологических процессов. Таким образом, создание органоидов, которые моделируют язык, имеет решающее значение для изучения развития и регенерации вкусовых клеток. Традиционные исследования вкуса in vivo могут быть дорогостоящими и трудоемкими.
Этот органоидный протокол предлагает стандартизированную, воспроизводимую альтернативу, которая сводит к минимуму эти проблемы, позволяя проводить эксперименты с более высокой пропускной способностью. После усыпления взрослой мыши используйте большие стерильные ножницы для рассечения, чтобы разрезать щеки и сломать челюсть. Затем поднимите язык и отрежьте язычную уздечку, чтобы отделить язык от дна ротовой полости.
Вырежьте язык и соберите его в стерильный ледяной dPBS с кальцием и магнием. Под рассекающим микроскопом удалите и отбросьте передний язык, разрезав только переднюю часть межъядородового возмещения лезвием бритвы. Затем с помощью деликатной салфетки удалить волосы и лишнюю жидкость с заднего языка.
Затем заполните шприц на один миллилитр от 200 до 300 микролитров инъекционного ферментного раствора и вставьте полудюймовую иглу 30 калибра чуть выше межмаларной возвышения до передней части циркумвалляционных сосочков или CVP. Вводят раствор фермента под и по боковым краям CVP между эпителием и подлежащими тканями. Медленно и непрерывно вынимайте шприц из языка во время инъекции раствора.
Инкубировать язык и стерильный dPBS без магния кальция при комнатной температуре в течение ровно 33 минут. Используя сверхтонкие ножницы для рассечения, сделайте небольшие надрезы в эпителии двусторонне и непосредственно с передней частью CVP. Затем аккуратно очистите эпителий, подняв его тонкими щипцами.
Как только эпителий траншеи освободится от подлежащей соединительной ткани, поместите его в двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку, предварительно покрытую FBS. Добавьте коктейль фермента диссоциации в трубки, содержащие очищенный эпителий CVP, и инкубируем их на водяной бане с 37 градусами Цельсия в течение 45 минут с коротким вихрем каждые 15 минут. В течение последних 15 минут инкубации, в предваренный период 0,25% трипсина-ЭДТА на водяной бане.
После инкубации вихрь трубки в тритурате стеклянной пипеткой Пастера в течение одной минуты. После того, как кусочки ткани оседают, пипетку супернатанта, содержащего первую коллекцию диссоциированных клеток, в новые микроцентрифужные трубки, покрытые FBS, размером 1,5 миллилитра. Вращайте супернатант в течение пяти минут при 370 G и четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать клетки.
Извлеките полученный супернатант, затем повторно суспендируют гранулу ячейки в буфере FACS и удерживайте ее на льду. Чтобы диссоциировать оставшиеся кусочки ткани в исходных двух миллилитрах микроцентрифужных пробирок, добавляют предварительно нагретый 0,25% трипсина-ЭДТА и насиживают при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут с коротким вихрем каждые 10 минут. Затем обрубите кусочки ткани стеклянной пипеткой Пастера в течение одной минуты.
После того, как кусочки ткани осядут, пипетку супернатанта в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки, содержащие ранее собранные диссоциированные клетки в буфере FACS. Раскрутите трубки диссоциированными клетками. После удаления супернатанта повторно суспендируют гранулы клеток в буфере FACS и удерживайте их на льду.
Затем изолируйте положительные клетки Lgr5-GFP через FACS, используя зеленый флуоресцентный белковый канал, как описано в текстовой рукописи. Перенесите нужное количество положительных взвешенных клеток Lgr5 в новую микроцентрифужную трубку. Вращайте трубку в течение пяти минут при 370 G и четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать клетки.
Удалите супернатант и поместите трубку на лед. Аккуратно повторно суспендируйте гранулу ячейки в соответствующем количестве матричного геля с щадящим пипетированием. Затем держите трубку микроцентрифуги на льду в конической трубке размером 50 миллилитров, чтобы предотвратить гелеобразование матричного геля.
Добавьте 15 микролитров матричного геля в клеточную смесь в центр каждой лунки 48-луночной пластины. Чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, смешайте матричный гель и клеточную смесь путем пипетирования вверх и вниз после покрытия каждые три скважины. Поместите пластину в инкубатор при температуре 37 градусов цельсия, 5% углекислого газа и влажности 95% в течение 10 минут, чтобы обеспечить гелеобразование матричного геля.
Затем добавьте 300 микролитров среды WENRAS комнатной температуры, дополненной ингибитором породы Y27632, к каждой скважине и верните пластину в инкубатор. Через два дня после нанесения покрытия удалите жимы из каждой скважины с помощью одной миллилитровой пипетки или с помощью вакуум-аспирации, обеспечивая отсутствие перекрестного загрязнения между условиями. Добавьте 300 микролитров среды WENRAS вниз по боковой стороне лунки, заботясь о том, чтобы не нарушить матричный гель и вернуть пластину в инкубатор.
Когда лингвальные органоиды культивируются с использованием среды WENR, они не растут эффективно. Однако после добавления A 83-01, ингибитора сигнализации TGF-beta, и SB202190, сигнального ингибитора P-38 map киназы, наблюдается устойчивый рост. Интересно, что удаление этих ингибиторов из среды через шесть дней приводит к более высокой экспрессии общего маркера клеток вкусовых рецепторов, Kcnq1, предполагая, что A 83-01 и SB-202190 препятствуют дифференцировке вкусовых клеток.
Таким образом, оптимальный рост и дифференциация получаются путем культивирования органоидов в средах WENRAS с нулевого по шестой день и средах WENR с шестого по 12-й день. Зрелые органоиды содержат как вкусовые клетки, отмеченные кератином-8, так и невкусные эпителиальные клетки, отмеченные кератином-13. Кроме того, кератин-13 экспрессируется на более высоких уровнях, чем все три маркера клеток вкусовых рецепторов, что позволяет предположить, что органоиды преимущественно состоят из невкусных эпителиальных клеток.
Органоиды экспрессивают все типы клеток вкусовых рецепторов. Клетки типа один, отмеченные Entpd2, и горькие клетки типа два, отмеченные Gnat3, высоко экспрессируются во вкусовых органоидах, в то время как кислые чувствительные клетки типа три, отмеченные Car4, встречаются реже. Клетки вкусовых рецепторов случайным образом распределены в органоидах, а не в дискретных структурах вкусовых рецепторов, наблюдаемых in vivo.
Обязательно включите некоторую ткань по задним к CVP при рассечении языка от ротовой полости. Кроме того, убедитесь, что обе траншеи выскакивают и получаются при шелушение эпителия.
