Этот протокол использует индуцированные плюрипотентные стволовые клетки для дифференцировки их в клетки легких, чтобы смоделировать заболевание легких человека и развитие в чашке. Этот протокол важен, потому что трудно получить и культивировать первичную легочную ткань человека. Основными преимуществами дифференцировки клеток легких от плюрипотентных стволовых клеток является постоянный запас специфических клеток легких для изучения развития легких и заболеваний человека.
Эти клетки могут поддерживаться в клеточной культуре в течение длительных периодов времени, могут быть криоконсервированы для будущих применений и могут быть генетически изменены для изучения генных мутаций. Продемонстрировать процедуру будет Рэйчел МакВикар, кандидат наук из моей лаборатории. Перед началом эксперимента медленно разморозьте пониженный фактор роста, или СКФ, матричную среду базальной мембраны на льду и разбавьте ее в равном объеме холодного DMEM F12.
Поместите наконечники P1000 в морозильную камеру для охлаждения перед использованием. Затем покройте каждую скважину из 12 луночных плит 500 микролитрами 50% матричной среды базальной мембраны СКФ и удалите любую избыточную смесь среды и пузырьки из скважин. Поместите плиты колодца поверх влажного льда или холодильника при четырех градусах Цельсия, чтобы установить на 20 минут, затем переместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на ночь.
Когда высокие PSE достигают 70% конфлюентности, добавьте 10 микромолярного ингибитора ROCK Y27632 к плюрипотентным стволовым клеткам, индуцированным человеком, и подождите час до диссоциации. Аспирируйте среду и промывайте клетки один раз с помощью PVS. Диссоциируют IPSC, добавляя 500 микролитров среды отслоения клеток на лунку, и инкубируют в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия в инкубаторе диоксида углерода 5%.
После инкубации добавляют 500 микролитров среды для прохождения стволовых клеток на лунку. Аккуратно пипетку клеток с помощью наконечника P1000 для получения одноклеточной суспензии. Затем переместите диссоциированные клетки в 15-миллилитровую трубку и центрифугу в течение пяти минут в 300 раз больше G. После центрифугирования аспирируют среду и повторно суспендируют клеточную гранулу одним миллилитром среды mTeSR Plus, дополненной 10 микромолярным ингибитором ROCK.
После подсчета клеток добавьте два раза по 10 к пятому IPSC в каждую лунку из 12 лунок GFR со средним покрытием и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия. На следующий день аспирируйте mTeSR Plus перед добавлением окончательной энтодермы, или DE, индукционной среды. На второй и третий дни измените индукционную среду DE.
На четвертый день начните индукцию AFE, заменив индукционную среду DE базальной средой без сыворотки. Меняйте среднюю AFE ежедневно в течение трех дней, прежде чем анализировать эффективность AFE в конце шестого дня. На седьмой день разморозьте матричную среду базальной мембраны СКФ на льду для последующего использования.
Одновременно приступают к дифференцировке клеток-предшественников легких путем аспирации среды AFE и промывки колодцев PVS. Добавить в лунку один миллилитр раствора для отслоения клеток и инкубировать в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации добавляют один миллилитр закалочной среды в скважину, содержащую раствор для отслоения клеток.
Храните ячейки в виде агрегатов, осторожно пипетируя вверх и вниз. Убедитесь, что все клетки смещены, но для переноса их в 15-миллилитровую коническую трубку для центрифугирования в 300 раз G в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в индукционной среде LPC.
Подсчитайте клетки и добавьте 2,5 раза по 10 к пятой клетке до 100 микролитров холодной субамбулаторной мембранной матричной среды СКФ и хорошо перемешайте. Поместите каплю в лунку из 12-луночной пластины и высиживайте при 37 градусах Цельсия в течение 30-60 минут. Затем добавьте один миллилитр среды LPC на скважину, гарантируя, что капля среды полностью погружена и инкубируется в течение ночи при 37 градусах Цельсия.
На восьмой день измените среду LPC, чтобы удалить ингибитор ROCK Y27632. Продолжайте менять медиа через день и анализируйте эффективность LPC в конце 16-го дня. На 17 день промыть колодцы и добавить 500 микролитров по два микрограмма на миллилитр диспазу.
Пипетку рассеивают смесью с пипеткой P1000 и инкубируют в течение 15 минут, затем пипетку смеси и инкубируют еще 15 минут. После инкубации добавляют один миллилитр закалочной среды к диспазе, содержащей колодцы, и переносят клетки в конические трубки. Центрифугируют и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре охлажденного ПВС, затем повторяют центрифугирование.
Затем повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре среды отслоения клеток. Инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в течение 12 минут, затем добавьте равный объем закалочной среды и центрифугу снова. Повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре закалочной среды и 10 микромолярной ингибиторе ROCK Y27632.
Выполните подсчет ячеек, чтобы рассчитать объем, необходимый для получения восьми раз 10 до четвертой ячейки на лунку. Затем аликвота необходимого объема клеточных агрегатов LPC в 1,5 миллилитра микроцентрифужных трубок и центрифуги в течение пяти минут в 300 раз больше G. Удаляют избыток супернатанта без перемешивания ячейки гранулы, оставляя 10 микролитров остаточной среды. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 200 микролитрах холодной матричной среды базальной мембраны СКФ и переносят клетки на мембранные вставки клеточной культуры.
Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-60 минут. После инкубации добавьте один миллилитр 3D органоидной индукционной среды в базолатеральную камеру вкладыша и заменяйте ее свежей средой через день в течение шести дней. На 23-й день переключите среду на 3D-среду ветвления, затем меняйте среду через день в течение шести дней.
На 29-й день перейдите на 3D-среду созревания и продолжайте заменять среду через день в течение следующих шести дней. На четвертый день индукции DE присоединенные клетки демонстрируют компактную морфологию булыжника. Были экспрессированы окончательные маркеры энтодермы CXCR4 и SOX17, наложенные ядрами, что подтверждает энтодермальную дифференцировку.
Индукция передней кишки была подтверждена на седьмой день с морфологией, показывающей более плотно уплотненные клетки, а маркеры FOXA2 и SOX2 наложены ядрами. Генерация 3D-клеток-предшественников легких была подтверждена 3D-сфероидами, а эндогенная экспрессия NKX2-1 GFP в репортерной клеточной линии. После трехнедельной дифференцировки в цельные леговидные органоиды маркеры легких анализировали методом иммуноцитохимии.
Маркеры ветвящегося морфогенеза SOX2 и SOX9, наложенные ядрами, наблюдались в органоидах. Проксимальные маркеры легких P63 и KRT5, оба маркера базальных клеток, были успешно обнаружены вместе с SCGB3A2, который является маркером для клубных клеток. Дистальные легочные маркеры индуцировали маркеры Pro SPC и SPB для альвеолярных клеток типа II.
И маркеры HOPX альвеолярных клеток I типа. Кроме того, NKX2-1 и ZO1 были экспрессированы наложенными ядрами. Маркеры клеток мезенхимы легких PGFR Alpha, маркер фибробластов, экспрессируемые совместно с SOX9, представляли собой дистальный мезенхим.
Виментин также экспрессировался и рассеивался по всему легкому. После этой процедуры органоиды легких могут быть инвестированы с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками, полученными из эндотелиальных и иммунных клеток. Развитие легких и заболевание происходит путем передачи сигналов между популяциями эпителиальных и мезенхимальных клеток, а также эндотелиальными клетками и макрофагами.
3D-система моделирования легочной ткани клинически актуальна для изучения заболеваний человека и терапии.
