Этот протокол направлен на упрощение подготовки библиотек с низким уровнем ввода, малых РНК-секвенирования от ранних эмбрионов до точного профиля микроРНК, которые регулируют эмбриональное развитие. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет избежать объединения низко входных образцов и может быть легко применен как к не отсортированным, так и к отсортированным ячейкам. Мы также демонстрируем тщательную постановку эмбрионов, чтобы избежать вариантов между репликациями.
Этот метод может быть применен к височных, генетических и исследований в области развития или других приложений, где концентрации РНК ввода являются низкими. В будущем этот метод потенциально может быть использован для диагностики нарушений развития, при которых микроРНК регулируются дисрегией. Наиболее технически сложной частью этого протокола является вскрытие эмбриона.
Потому что каждый эмбрион должен быть вскрыт, этап, изображение, а затем отмежеваться быстро, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток. Чтобы вскрыть эмбрионы, промыть матку беременной самки мыши с помощью PBS и поместить его в стерильный пластик 10 сантиметров блюдо. Используйте ножницы микроперегибки, чтобы отделить decidua содержащие области и отслаить мышцы матки, чтобы разоблачить все decidua.
Чтобы вскрыть эмбрионы, промыть матку беременной самки мыши с помощью PBS и поместить его в стерильный пластик 10 сантиметров блюдо. Используйте ножницы микропересмешки, чтобы отделить решающую область, содержащую. Переместите все эмбрионы в новое блюдо с чистым PBS и возьмите изображение всего помета.
Затем изображение каждого эмбриона по отдельности, и подсчитать количество somites, сохраняя увеличение и воздействие постоянной между экспериментами. Для эмбрионов старше E8.0, обезглавить чуть выше otic placode и передать голову в чистый колодец 48-хорошо пластины. Добавьте 250 микролитров папаина в колодец и пипетки вверх и вниз осторожно.
Используйте микроскоп, чтобы проверить на комки и продолжать трубопроводов вверх и вниз, пока одна подвеска ячейки не будет достигнута. Затем добавьте 250 микролитров FBS в клетки и процепив 500 микролитров подвески через 35-метровый нейлоновый сетчатый фильтр. Перемести фильтрат в новую 1,5 миллилитровую трубку и закрути ее на 200 х г в течение пяти минут.
Перенесите супернатант в новую трубку и повторно нанесите клеточные гранулы в 300 микролитров PBS с BSA. Когда готовы сортировать фильтр клетки снова через трубку крышки фильтра и добавить DAPI для окрашивания живых клеток. Используйте сортер клеток с 70 микрометровым соплом, чтобы сортировать каждый образец в 500 микролитров раствора лиза извлечения РНК, затем смешать и хранить образец при отрицательных 80 градусах по Цельсию.
Добавьте пять микролитров 6X погрузочного красителя к каждому образцу и перемешайте с помощью пипетки. Загрузите образцы на 6%TBE полиакриламидный гель, начиная с последнего в первой хорошо и оставляя одну полосу между каждым образцом. Запустите гель на 150 вольт в течение 30 до 40 минут в 0.5X TBE работает буфер.
Когда гель закончит работать, осторожно снимите его со стеклянных пластин и поместите его в лоток из оригинальной упаковки, увековечив ориентацию. Удалите бегущий буфер и окрашиваете гель в течение 15 минут. А затем изображение его на УФ транс-иллюминатор.
Определите полосу на 150 базовых пар и использовать чистый лезвие бритвы, чтобы акциз его. Убедившись, чтобы избежать адаптера димер продукт на 130 базовых пар. Положите ломтики геля в микроцентрифуг трубки и спина их вниз на максимальной скорости в течение 30 секунд.
Затем используйте наконечник P200, чтобы раздавить ломтик геля на самые маленькие кусочки и выбросить кончик в трубку. Добавьте 300 микролитров буфера элюции в каждую трубку, стирая кусочки геля со стороны. Прикрепите кончик пипетки и смойте его перед удалением из трубки.
Инкубировать образцы на ночь при 25 градусах по Цельсию с 1000 об /мин встряхивания. На следующий день, спина их вниз на максимальной скорости в течение 10 минут и передачи supernatant на RNase-бесплатно 96-хорошо пластины. Добавьте 50 микролитров бус для очистки в каждый образец и пипетку для смешивания.
Затем добавьте 350 микролитров изопропанола, смешайте образец и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 10 минут во время качания. После инкубации, потяните спина пластины и намагничить его в течение двух минут. Откажитесь от супернатанта и помойте бисер 950 микролитров 80%этанола в течение 30 секунд.
Высушите образец в течение трех минут, затем удалите всю остаточную жидкость на дне хорошо. Снимите пластину с магнитного стенда. И повторно посовещение бисера в 13 микролитров буфера повторного незаменимия.
Инкубировать пластину в течение двух минут, а затем передать его обратно на магнитный стенд в течение трех минут. Перенесите 12 микролитров супернатанта в чистую трубку и храните его на ночь при четырех градусах Цельсия или в долгосрочной перспективе при отрицательных 20 градусах по Цельсию. Эмбрионы на E7.5, E8.5 и E9.5 были собраны.
И somite поставил решить шестичасовые интервалы времени. Когда анализ принципиальных компонентов использовался для группы образцов на основе сходства, было установлено, что образцы группируются по возрасту. Premigratory и мигрирующие нервные клетки гребня были обозначены то E8.5 с Wnt1-Cre и E9.5 с Sox10-Cre.
Сравнение двух драйверов CRE подтверждает, что они отмечают различные популяции в ранних эмбрионах мыши. РНК была количественно с спектрофотометром и капиллярным электрофорезом. Хотя спектрофотометр след показал, что РНК не содержит загрязняющих белков и высокой концентрации клеток, он не был достаточно чувствительным, чтобы обнаружить изменения в концентрации РНК с возрастом.
След капиллярного электрофореза может быть использован для оценки концентрации и размера фрагментов РНК. Пики на 2000 и 5, 100 нуклеотидов 18S и 28S рибосомной РНК, соответственно. В то время как небольшой регион РНК находится на уровне около 150 нуклеотидов.
Извлечение геля может быть использовано для изоляции небольших библиотек секвенирования РНК от праймеров адаптера. Перед иссечением в каждом образце присутствует множество размеров продукта. Капиллярные следы электрофореза до и после выбора размера показывают улучшение чистоты 150 базовых пар библиотечного продукта после очистки геля.
Мы разработали этот протокол, чтобы разделить подготовку РНК из одного образца как в небольшие библиотеки секвенирования РНК, так и в библиотеки последовательности мРНК. Это позволит решить вопросы, связанные не только с выражением микроРНК, но и с тем, какие цели мРНК могут регулироваться выраженными микроРНК. Этот метод позволил нам получить полное представление о наиболее высоко выраженных микроРНК и регуляции их целей в черепных нервных клетках гребня между гастрипуляцией и закрытием нервной трубки.
