Этот мурин экстрагепатический желчный проток органоидной системы может решить ограниченный доступ к доклинктической холангиопатии моделей и ограничения плюрипотентных стволовых клеток и печени полученных холангиоцитов органоидных моделей. Наша модель специфична для взрослых, дягецична, воспроизводима, а также эффективна во времени и затратах. Это будет иметь особое преимущество для лабораторий, которые не имеют доступа к человеческим тканям.
Наша методика позволяет культивирование почти неограниченного количества экстрагепатических желчных протоков холангиоцитов для изучения регенерации тканей и взаимодействия клеток с клетками. Демонстрацией процедуры будет Дзюня Шиота, пост-док из моей лаборатории. Для внутрицепочной изоляции желчных протоков поместите взрослую мышь в положение на спине и откройте брюшную полость вдоль средней линии.
Втягивайте печень, чтобы отдохнуть на диафрагме и используйте гемостат, чтобы мягко вытащить проксимальный двенадцатиперстной носик, чтобы выявить общий желчный проток непосредственно под хилум печени. Используйте скальпель, чтобы отделить экстрагепатический желчный проток от окружающих тканей. Холдинг проксимальный конец общего желчного протока с типсами, вскрыть проток distally чуть выше его стыка с двенадцатиперстной носиком перед вскрытием проксимального конца протока из печени.
Немедленно поместите изолированный экстрагепатический желчный проток в стеклянную пластину, содержащую холодный стиральный буфер на льду, затем очистите желчный проток от окружающих тканей и фарш в 0,5-миллиметровые секции. Когда все ткани были измельчены, перенесите секции в трубку, содержащую 500 микролитров буфера диссоциации для 20-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия. В конце диссоциации, нейтрализовать буфер с 500 микролитров ледяной клеточной культуры среды и тритурировать подвеску ткани 20 раз через 18-калиберной иглы, а затем 20 раз через 20-калиберной иглы.
Затем процедите полученную подвеску клетки через 70-микрометровый клеточный ситечко в 50-миллилитровую трубку. Чтобы установить желчный органоид культуры, собирать клетки центрифугации и тщательно удалить супернатант. Повторное распределение гранул в один миллилитр ледяной, стерильный PBS и передачи клеток в 1,5-миллилитровую трубку для второй центрифугации.
Resuspend промытые гранулы в 120 микролитров сликовой, ледяной подвал матрицы и пластины 40 микролитров клеток в центре каждого из трех скважин 37 градусов по Цельсию нагревается, 24-хорошо пластины, а затем поместить пластину в 37 градусов по Цельсию ткани культуры инкубатор около 15 минут. Когда цокольный матрицы затвердеет, добавить 600 микролитров 37 градусов по Цельсию посева среды для каждого задолго до возвращения пластины в инкубатор. Через три дня и каждые три дня после этого, заменить посев среды с 600 микролитров свежей органоидной культуры среды, мониторинг роста органоидов регулярно с перевернутым микроскопом.
Для прохождения экстрагепатических культур желчных протоков, пипетка органоидов в каждом хорошо с 400 микролитров ледяной PBS 10 раз за задолго до передачи содержимого колодец в отдельных 1,5-миллилитровых труб. Прохождение каждой смеси через 25-калиберной иглы четыре раза, чтобы разобщить органоиды и собирать клетки центрифугации. Затем повторное покрытие клеток в цокольной матрице при соответствующем соотношении для повторного покрытия.
Для длительного экстрагепатический желчный проток органоидного хранения, мыть каждый колодец органоидов с комнатной температуры PBS, не нарушая подвал матрицы капель и добавить 500 микролитров ледяной замораживания среды для каждой хорошо. Аккуратно пересаживайте органоиды и перенесите смесь в отдельные криогенные флаконы, затем поместите флаконы при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 48 часов перед передачей органоидов в азотный резервуар для длительного хранения в паровой фазе. Чтобы подготовить органоиды для встраивания парафина, замените носитель на 500 микролитров четырех градусов по Цельсию PBS и перенесите суспензию из каждого хорошо в отдельные 1,5-миллилитровые трубки, содержащие сликовую матрицу подвала.
Соберите органоиды путем центрифугации и используйте модифицированный наконечник пипетки P1000, чтобы тщательно удалить супернатанты, не нарушая гранулы. Затем добавьте один миллилитр ледяного, 4%paraformaldehyde к органоидам для ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию. На следующее утро замените фиксатор на один миллилитр комнатной температуры PBS на пятиминутную инкубацию при комнатной температуре и помойте органоиды центрифугой в три раза.
После последней стирки, повторно органоидов в один миллилитр 30% этанола для пятиминутной инкубации при комнатной температуре, а затем пятиминутной инкубации в один миллилитр 70%этанола при комнатной температуре. В конце инкубации 70% этанола, собирать органоиды центрифугации и повторно органоидов в один миллилитр 100% этанола в течение пяти минут при комнатной температуре. В конце 100% инкубации этанола, тепла образца обработки геля в микроволновой печи в течение 20 секунд или до liquified, и добавить 50 микролитров ликовидного геля для каждой трубки органоидов.
Поместите трубки на лед до тех пор, пока гель для обработки образцов не затвердеет и не перенесите каплю органоидов из каждой трубки между синими губчатыми прокладками в кассету для дальнейшей обработки в парафиновом встраиваемом. Поместите кассету в тканевой процессор, запрограммированный на 15 минут в шаг, а затем раздел парафин-встроенных органоидов в образец обработки геля на четыре микрометра в разделе для иммуногистохимического окрашивания и анализа в соответствии со стандартными протоколами. Экстрагепатический желчный проток органоидного покрытия эффективность составляет около 2%, когда изолированы от новорожденных или взрослых мышей.
После прохождения два, покрытие эффективность экстрагепатических желчных протоков органоидов, полученных из взрослых мышей увеличивается до 11% и остается стабильным. Большинство органоидов демонстрируют кистозную морфологию во всех проходах с редкими нерегулярными органоидами. Органоиды достигают пика роста в пять-семь дней, после чего они начинают накапливать внутрисветовой мусор и ухудшаться.
Поэтому для поддержания органоидной культуры органоиды следует расщепать каждые семь-десять дней. При анализе с помощью иммунофлюоресценции внегепатические органоиды желчных протоков состоят из чистой популяции эпителиальных клеток, отмеченных Е-кадерином. Органоидные клетки также демонстрируют маркеры желчных клеток-предшественников, а также маркеры желчной дифференциации.
Важно отметить, что высокий процент органоидных клеток обладают первичным цилием, отмеченным ацетилированной альфа-тубулином, который является особенностью нормальных холангиоцитов и предполагает соответствующую поляризацию органоидных клеток. Требуется тесная приверженность описанной температуре. Тщательное рассечение желчных протоков предотвращает загрязнение клеток поджелудочной железы.
Потери клеточного материала можно избежать путем тщательных манипуляций после центрифугации. Эти органоиды могут быть использованы в качестве доклинических моделей, генетически и фармакологически манипулировать, или использоваться для тестирования наркотиков и эффекты инфекционных агентов. Этот метод может быть использован лабораториями, которые хотят воспользоваться генетически модифицированными моделями мыши для дальнейшего изучения механизмов биологии холангиоцитов.
