Этот протокол описывает простую технику, которая может быть использована для обнаружения присутствия и измерения длины гликозаминогликанов, которые являются молекулами, все более признанными для многих биологических процессов. Этот метод легко адаптируется к большинству лабораторий наук о жизни. Сопоставимые гликомические методы часто требуют оборудования и опыта, которые можно найти только в исследовательских лабораториях гликохимии.
Этот метод может быть особенно полезен для исследователей, которые заинтересованы в изучении гликокаликса, полисахаридной оболочки, которая выстилает эндотелиальные и эпителиальные поверхности человеческого тела. Начните с помещения пустой кассеты в бак PAGE. Отлить рассасывающий гель, смешав 10 миллилитров раствора рассасывающего геля с 60 микролитрами свежеприготовленного 10% персульфата аммония в 15-миллилитровой пробирке.
Затем добавьте 10 микролитров TEMED. Осторожно переверяют трубку два-три раза. Быстро добавьте 10 миллилитров активированного раствора полиакриламидного геля в кассету с помощью пипетки.
Наложить два миллилитра деионизированной фильтрованной воды и дать рассасывающейся гелю полимеризоваться в течение 30 минут. После того, как рассасывающий гель полностью полимеризуется, отбросьте наложенную воду. Отлить укладочный гель, смешав три миллилитра раствора укладывающего геля с 90 микролитрами свежеприготовленного 10%-го персульфата аммония в 15-миллилитровой трубке.
Затем добавьте три микролитра TEMED и аккуратно переверглите трубку два-три раза. Используйте пипетку, чтобы быстро добавить раствор геля для укладки поверх затвердевания разрешающего геля до тех пор, пока кассета не будет заполнена до краев. Полностью вставьте гребень, входящий в комплект пустой кассеты с полиакриламидным гелем, и дайте укладываемый гель полимеризоваться в течение 30 минут.
После полимеризации геля снимите ленточную полоску со дна кассеты и поместите кассету обратно в сборку резервуара PAGE. Заполните верхнюю и нижнюю камеры соответствующими буферными растворами. Растворяют высушенные образцы гликозаминогликана в минимально необходимом объеме деионизированной фильтрованной воды и смешивают с буфером загрузки проб в соотношении один к одному.
Загрузите образцы и олигосахаридные лестницы HS в гель. Предварительно запустите гель в течение пяти минут при 100 вольтах, затем запустите его при 200 вольтах в течение 20-100 минут, в зависимости от процента акриламида в растворяющейся гелевой растворе. Как только запуск будет завершен, разберите кассету и аккуратно извлеките гель в большой чистый контейнер, наполненный деионизированной фильтрованной водой.
Затем отбросьте воду и окрасьте гель в альциановом синем окрашивательном растворе в течение пяти минут. Отбросьте синее пятно Alcian и быстро промойте два-три раза деионизированной фильтрованной водой, пока большая часть раствора для окрашивания Alcian blue не будет удалена. Окрасите гель раствором для окрашивания нитратом серебра в свежую чистую емкость на 30 минут.
Затем промыть два-три раза в течение 30 минут каждый в деионизированной фильтрованной воде, чтобы полностью удалить раствор для окрашивания серебра. Выбрасываем воду и добавляем развивающий раствор. Внимательно следите за гелем для появления полос.
В зависимости от качества пятна и массы загруженного образца, разработка может занять от нескольких секунд до нескольких минут. Как только будут видны нужные полосы, немедленно отбросьте развивающийся раствор и ненадолго промойте гель раствором СТОП. Изолированные и очищенные гликозаминогликаны визуализировали с использованием техники окрашивания алциановым синим и серебристым цветом после плотнозависимого разрешения электрофорезом полиакриламидного геля.
Как видно на этом рисунке, олигосахариды гепарана сульфата различной длины полимера были легко обнаружены с использованием этого подхода, основанного на PAGE. Предел обнаружения этого метода, всего 0,5 микрограмма, показывает, что метод очень чувствителен при обнаружении гликозаминогликанов, выделенных и очищенных из биологических образцов. Из четырех различных олигосахаридов гепарина сульфата, визуализированных с использованием этого метода, нефракционированный гепарин был наименее легко обнаруживаем.
Из-за полидисперсности нефракционированного гепарина плотность каждой отдельной полосы из этого образца ниже, чем полос, образующихся равной массой очищенных олигосахаридов гепарина. Эффективность очистки гликозаминогликанами из жидких биологических образцов оценивали с использованием образцов бронхоальвеолярного лаважа, собранных у мышей, которые первоначально содержали относительно низкие концентрации гликозаминогликанов. Кроме того, успех этого метода был продемонстрирован с использованием гепарина сульфата, выделенного из цельного гомогената легких, который дал достаточное количество изолированного гепарина сульфата, причем мельчайшие фрагменты равны примерно 10 субъединицам дисахарида по массе.
Очень важно использовать свежеприготовленные реагенты и фильтровать каждый реагент, используемый в этом протоколе. Для успешного выполнения этой методики очень важно использовать реагенты высочайшей чистоты и качества.
