Это новый гель-окрашивания метод, который использует флюорогенный серебряный зонд для преобразования традиционного окрашивания серебра в флуоресцентное окрашивание серебра. Этот метод показал улучшенную производительность по сравнению с обычными окрашивания нитратов серебра и SYPRO Ruby окрашивания при использовании простой и простой протокол без альдегидов. Демонстрацией процедуры будет Алекс Вонг, научный сотрудник из моей лаборатории.
Чтобы начать эту процедуру, разбавить образцы белка с раствором, содержащим дистиллированной воды, буфер СПД, и образец снижения агента. Настройка мини-гель танк заполнен МЕШ буфер для выполнения SDS-PAGE с 4-12%Bis-Tris белка гель. Загрузите скважины с подготовленным образцом белка, затем запустите гель при постоянном напряжении 200 вольт в течение 30 минут.
После электрофореза, погрузите гель в 100-миллилитровый раствор, содержащий этанол и уксусную кислоту на орбитальном шейкере и инкубировать дважды в течение 30 минут каждый при комнатной температуре при встряхивании при 50 об/мин. Затем трижды промойте гель ультрачистой водой в чистом контейнере с каждой стиркой продолжительностью 10 минут. Во-первых, растворить 0,01 грамма нитрата серебра в 10 миллилитров ультрапурной воды, чтобы подготовить фондовый раствор с концентрацией 0,1%Добавить 100 микролитров раствора бульона в 100 миллилитров ультрапурной воды, чтобы сделать серебряную нитрат рабочим раствором.
В дымовой капот, погрузить гель в 100 миллилитров серебряной селитры рабочий раствор в герметичной стеклянной камере. Используйте алюминиевую фольгу, чтобы защитить гель от света во время пропитки и инкубировать в течение одного часа при встряхивании при 50 об/мин на орбитальном шейкере. После этого, мыть гель дважды с ультрачистой водой в чистом контейнере, с каждой стирки с использованием примерно 100 миллилитров воды и продолжительностью 60 секунд.
Важно использовать ультрачистую воду для очистки геля после шага пропитки серебра, чтобы свести к минимуму фоновое окрашивание. Во-первых, добавьте 50 миллилитров ультрачистой воды в три миллиграмма красителя TPE-4TA. Sonicate раствор в течение трех минут и добавить пять микролитров одного молярного раствора гидроксида натрия между каждой сессии sonication, чтобы помочь растворить краситель, как правило, до трех раз.
Затем проверьте флуоресценцию раствора под 365-нанометровой ультрафиолетовой лампой, чтобы убедиться, что краситель полностью растворяется. Только слабые или несуществельные решения указывают на полный растворение. Для приготовления фторгенного раствора добавьте 10 миллилитров раствора бульона TPE-4TA в 90 миллилитров ультрачистой воды.
Используйте рН метр, чтобы проверить рН раствора. Настройте раствор на рН между 7 и 9, используя разбавленный раствор гидроксида натрия или уксусную кислоту, если рН находится вне диапазона. Затем перенесите гель в чистый и герметичный контейнер со 100 миллилитров фторгенного развивающегося раствора и убедитесь, что гель полностью погружен.
Печать контейнера и покрыть его, чтобы защитить его от света. Встряхните контейнер на ночь на орбитальном шейкере при 50 об/мин и при комнатной температуре. Перенесите гель в чистый контейнер и обезволите его в 100 миллилитров 10%этанола в течение 30 минут.
Затем промыть гель в ультрапурной воде в течение пяти минут. Гель можно визуализировать на скамейке трансиллюминатора или изображен на геле-документации на 365-нанометровом канале или 302-нанометровом канале. В этом исследовании, новый флуоресцентный метод окрашивания серебра используется для окрашивания белков в полиакриламидных гелях.
Белковые полосы, окрашенные флуоресцентным серебряным пятном, обладают интенсивным зеленым цветом под 365-нанометровой ультрафиолетовой лампой. Все 14 белковых полос хорошо видны и хорошо коррелируют с красными полосами, окрашенными красителем SYPRO Ruby. Этот флуоресцентный метод окрашивания серебра, как представляется, имеют высокое разрешение.
Для некоторых белковых полос чувствительность флуоресцентного пятна серебра также немного лучше, чем у флуоресцентного пятна SYPRO Ruby. В частности, улучшается производительность этого пятна для белковых полос от 10 до 40 килодалтонов, что указывает на то, что новый метод особенно полезен для обнаружения белков с низкой молекулярной массой. Как видно, данные также свидетельствуют о том, что флуоресцентное пятно серебра дает хорошую и однородную линейность для всех 14 белков в относительно широком диапазоне белковой количественной оценки.
В то время как пятно нитрата серебра дало высокий уровень фонового сигнала и искаженных пиков, флуоресцентное пятно серебра обнаружило полосы с хорошим контрастом и равномерной интенсивностью распределения, сопоставимого с пятном SYPRO Ruby во всех 14 белках. Стиральные шаги имеют важное значение, поскольку они ограничивают остаточный раствор фиксации от нарушения пропитки серебра или развития фторгена. При использовании нитрата серебра избегайте контакта с кожей.
Очистите любые разливы немедленно. Носите защитную одежду и перчатки и утилизировать как химические отходы.
