Stentor coeruleus уже давно используется в качестве модельного организма для понимания одноклеточной регенерации. Хотя временная шкала визуальной морфологической регенерации известна, временная шкала функциональной регенерации остается неизвестной. Этот анализ отслеживает подвижность центральной популяции, подвергающейся синхронизированной регенерации, так что восстановление функции потерь может быть количественно определено.
Он может быть адаптирован для использования с другими типами клеток. Отсутствие надежного уплотнения камеры визуализации приведет к утечке скважин друг в друга или образованию пузырьков воздуха внутри скважин. Для исследователей, незнакомых с использованием силиконовых распорок, мы настоятельно рекомендуем, чтобы PSW или другая чистая среда была пипетирована в каждую из скважин для проверки на утечку перед использованием.
Конструкция камер для образцов легче показана, чем устно описана. Как и процесс извлечения паттернов подвижности из полученных видеоданных. Для начала вырежьте кусок силиконового спейсерного листа толщиной 250 микрометров, немного меньший как по высоте, так и по ширине, чем слайд микроскопа.
Используйте целый перфоратор для создания круглых скважин, оставляя достаточно места между соседними скважинами для обеспечения хорошего уплотнения. Инициируют регенерацию орального аппарата путем инкубации стенторных клеток коэрулеуса в 10% сахарозы или 2%урии в течение двух минут. Затем трижды промыть свежей средой.
Аккуратно пипеткуйте примерно по 10 стенторов в каждую лунку. Забота о том, чтобы как можно точнее сопоставить объем пробы с объемом скважины. Закройте колодцы, осторожно опустив кусок покровного стекла над колодцами, начиная с одного края.
Используйте узкий и слегка гибкий объект, такой как 10-микролитровый наконечник пипетки, чтобы надавить на покровное стекло, где оно контактирует с силиконовым листом, чтобы обеспечить хорошее уплотнение. Поместите образец на ступень микроскопа и установите микроскоп на наименьшее доступное увеличение, чтобы он хорошо помещался в кадре. Начните таймлапс и получите десятисекундное видео со скоростью 30 кадров в секунду каждой скважины в каждый момент времени.
Для калибровки получите четкое изображение калибровочного слайда или четкой линейки при тех же настройках увеличения, что и видео. Используя любую программу для просмотра изображений, подсчитайте количество пикселей между отметками известного физического расстояния. Загрузите два скрипта, отслеживайте ячейки и очищайте следы в легко запоминающееся место на компьютере, а также передавайте видео данных на этот компьютер.
Организуйте видео с данными в папки. По одному на каждый момент времени. Используйте ячейки трека скрипта для выполнения автоматического отслеживания ячеек в видео данных, открывая ячейки трека и запуская сценарий Выберите добавить в путь», если запрашивается всплывающее окно, которое обычно происходит только при первом запуске скрипта из данной папки.
При появлении запроса выберите одно или несколько видео данных, чтобы начать отслеживание. Перейдите к видео с данными и, убедившись в списке файлов, нажмите на кнопку «Открыть» Чтобы вручную отклонить аномальные или ложные следы, откройте чистые следы в окне редактора MATLAB, дважды щелкнув по файлу. В командной строке выберите вывод папки данных по ячейкам трека.
Перейдите в одну из созданных папок и выберите ее. При появлении запроса введите единицу, чтобы сохранить трассировку, и ноль, чтобы отклонить трассировку. Затем нажмите клавишу ВВОД, чтобы перейти к следующей трассировке.
Начните с загрузки сценария под названием «Спагетти-сюжеты». Откройте и запустите сценарий. Когда появится окно файлового браузера с приглашением, выберите папку для открытия.
Перейдите в папку одной из точек времени. При появлении запроса на калибровку, каково количество пикселей на миллиметр? Введите калибровочное значение и нажмите клавишу ВВОД.
Отрегулируйте оси графика по мере необходимости, изменив строку 55 скрипта, которая по умолчанию установлена на RR равным четырем. для включения радиуса до четырех миллиметров. Сохраните участок.
Результаты показывают коллективную подвижность популяции стенторных клеток через два, три, семь и восемь часов в процессе регенерации орального аппарата. Эти графики показывают как ожидаемое увеличение числа подвижных особей, так и четырехкратное увеличение диапазона наиболее подвижных клеток в популяции. Самые быстрые плавающие клетки, если они начинаются близко к краю, ограничены от плавания полностью по прямой линии, и их диапазон движения кажется меньшим.
Клетки тракта были классифицированы на три отдельные категории: неподвижные без видимого удержания, неподвижные с видимым удержанием и подвижные. Результат показал сложенную гистограмму, суммирующую относительное количество клеток по этим категориям в зависимости от нашей регенерации. В более поздние времена значительное количество клеток было обнаружено в колониях с видимыми стойками удержания, что убедительно свидетельствует о том, что они исследовали окружающую среду и преимущественно прикреплялись рядом с другими в своем роде.
Важно выбрать размеры пробной скважины, которые хорошо работают для стентора coeruleus, размер которых составляет примерно один миллиметр. Это включает в себя силиконовую прокладку толщиной 5/16 дюйма в диаметре и 10 ячеек на лунку. Эти цифры должны быть скорректированы при адаптации этого протокола для других типов клеток.
Этот анализ может быть выполнен совместно с РНК-I для исследования и сравнения регенерации различных фенотипов стентора.
