Растет понимание влияния механической микроокноронности на сигнализацию клеток и миграцию. Необходимость использования уникальных, экспериментальных подходов для доставки механической стимуляции для отдельных клеток. Этот метод позволяет динамические манипуляции механической микро-среды под ячейкой в режиме реального времени.
Разрешение наблюдения механически регулируемых изменений в поведении миграции клеток и событий субклеточной сигнализации. Демонстрация процедуры со мной будет Найла Наим, пост-док и Джонатан Паттерсон, техник из нашей лаборатории. Начните с использования Chorono-1, чтобы активировать стеклянную поверхность каждого нижнего покрытия скольжения в течение 20 секунд, прежде чем сразу же более-укладка 50 микролитров связывания силанов рабочего решения на каждой крышке скольжения.
Дайте раствору высохнуть в течение 10 минут, прежде чем полоскать крышку скользит два раза с 95% этанола и два раза с изопропанолом. Затем, дайте крышке скользит в воздух сухой в течение примерно 20 минут. Для флуоресцентного осаждения микро-шарика, сначала sonicate рабочий раствор микро-шарика в течение одного часа.
За 15 минут до окончания звуковой обработки поместите активированную крышку вертикально в керамический держатель для скольжения крышки и перенесите держатель в плазменный очиститель столешного верха для обработки плазмы комнатного воздуха в течение трех минут. Далее поместите кусочки парафиновой пленки в 60 миллилитров петри крышки чашки, и поместите крышку скользит на пленках, слегка нажав каждый крышку скольжения, чтобы обеспечить хороший контакт между пленкой и крышкой. Затем добавьте 150 микролитров рабочего шарикового раствора в верхнюю часть каждой крышки и немедленно оспирировать раствор этанола со стороны крышки, оставив бисер на крышке.
Чтобы бросить Hydrogels сразу после их подготовки, добавить 25 микролитров капли раствора Гидрогеля в активированной стороне каждого нижнего крышки, и сразу же перевернуть бисером верхней крышки, бисером вниз, на капельку. Разрешить гели полимеризации в течение 30 минут, прежде чем использовать типсы, чтобы аккуратно удалить крышки. Затем, промыть гели с трех, пяти минут моет в свежем 50 miliMoler Hepes за стирку.
Чтобы активировать поверхности Hydrogels, инкубировать гели в свежем 50 miliMoler Hepes, дополненный 0,4 милиМолар Сульфо Санпа, и сразу же подвергать гели ультрафиолетовой лампы арки в закрытой области в течение 90 секунд. В конце активации, мыть гели с тремя, пять минут моет в свежем Hepes, и лечить активированных гидрогели с 20 микрограммов на миллилитр фибронектина в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации, аспирировать избыток фибронектина раствор, и мыть гели три раза в PBS в течение пяти минут за стирку.
После последней стирки поместите гидрогели в небольшой объем PBS и стерилизовать гели в течение 15 минут под ультрафиолетовым светом в капюшоне культуры ткани. Затем, мыть гели один раз в свежем PBS. Для покрытия клеток, семя 2,1 раза 10 четыре из клеток, представляющих интерес в трех миллилитров среднего на гидрогеля и позволяют клеткам придерживаться при 37 градусов по Цельсию в течение четырех до 18 часов.
В то время как клетки уравновешены, используйте микро-пипетку шкив тянуть тянуть один миллиметр диаметром на 100 миллиметров длиной borosilicate стекла микро-пипетки, чтобы получить конус более двух миллиметров, что уменьшается примерно до 50 микрометров в диаметре в первый миллиметр, и простирается до длинной, параллельной 10 микрометровой трубки диаметром в последний миллиметр. Затем загрузите пипетку в микрофоток и сформировой пипетки, чтобы иметь 15-метровый притупленный наконечник, который заключен в самом конце 250-метровой секции, согнутой при примерно 35-градусном ангеле от остальной части пипетки. Приблизительный диаметр на изгибе должен быть около 30 микрометров, чтобы придать прочность кончику.
Затем поместите гидрогель на сцену перевернутого микроскопа. Обложка среды с минеральным маслом и выбрать 10x цели. Стерилизовать подготовленную микро-пипетут с 70%-ым алкоголем.
Затем вставьте в держатель микро-пипетки с крючком указал на блюдо, и использовать курс манипулятора, чтобы опустить пипетку, пока крючок просто касается поверхности жидкости. Сосредоточьте микроскоп на клетках, прилипающихся к верхней части геля, и заботясь о том, чтобы цель не была в опасности попадания образца или стадии, привнесите фокус над гелем, чтобы найти кончик микро-пипетки. Поверните пипетку до тех пор, пока кончик перпендикулярно фокусной плоскости, так что тупой кончик микро-пипетки указывает вниз, и переориентировать на кончике пипетки по мере необходимости.
Сосредоточьтесь на клеточном слое, чтобы оценить, как далеко пипетка от поверхности геля, и сфокусироваться обратно до плоскости, которая находится на части пути между гелем и кончиком пипетки. Затем медленно опустите пипетку, чтобы достичь промежуточной фокусной плоскости, и увеличьте увеличение до того, что будет использовано в эксперименте, прежде чем опустить пипетку, пока она не зависет чуть выше поверхности Гидрогеля. Для калибровки микро-манипулятора, изображение области, лишенной клеток, области с бисером, но без манипуляций, с пипеткой привлечения гель, и с участием пипетки потянув гель.
Затем используйте изображение J, чтобы сравнить поля без бисера с полями бисера без участия, поля бисера с гелем, и вытащил гель для расчета относительных перемещений шарика и силы, применяемой к гелям. Для проведения анализа durotaxis, контролировать группу клеток в течение 30 минут, чтобы определить клетки, которые движутся в направленной манере. Выберите ячейку, которая постоянно движется в одном направлении, и следите за ячейками желаемой частоты кадров в течение еще 30 минут.
Далее, положение пипетки около 50 микрометров перед ближайшей стороне передней кромки выбранной ячейки, и переместить микро-манипулятор таким образом, что гель деформируется ортогонально в направлении клетки путешествия. Затем наблюдайте за клеткой с течением времени, когда она реагирует на острый, местный градиент жесткости Гидрогеля. Используя этот метод, как попродемонстрировано, крысы эмбриональных фибробластов двигаться в направлении повышенной жесткости в градиентах, применяемых стекло микро-пипетки.
Крысиные эмбриональные фибробластые клетки, преходяще выражаюющие датчик давления винкулина на 125 килопаскальных полиакриламидных гелях, также демонстрируют образование очаговых спаек в направлениях растяжения в течение 40 минут. Форстер Резонанс передачи энергии анализ показывает, что винкулин локализованных для фокусных спаек испытывает немедленное изменение напряжения, когда представлены с острой дуротатической стимуляции. Расширение полезности этого анализа для наблюдения за субклеточной сигнализации событий, в ответ на дуротаксическую стимуляцию.
Если вы делаете несколько попыток растянуть клетку, или если микроигла скользит во время анализа, начать все сначала с новой клеткой, чтобы избежать передачи нескольких, переменных, механических стимулов. Помимо своей полезности для анализа durotaxis, этот метод может быть объединен с генетическими подходами, такими как биосенсоры, РНКИ, или редактирование генов, чтобы помочь разграничить молекулярные механизмы, участвующие в механотрансдукции.
