Этот метод может помочь прояснить молекулярные механизмы, лежащие в основе регуляции генов-кандидатов-мишеней посредством эпигенетических модификаций во время грибкового патогенеза при патологии растений. Технология секвенирования иммунопреципитации хроматина может эффективно обнаруживать сегменты ДНК, которые взаимодействуют с гистонами и факторами транскрипции во всем геноме. По сравнению с другими методами, он может повысить эффективность и разрешение.
Начните с добавления 100 микролитров жидкой полной среды к тарелкам овсяных помидоров Agger с использованием пипетки объемом 100 микролитров. Используя петлю прививки, соскоблите мицелий штамма дикого типа и нокаутирующего штамма. Соберите остатки мицелия и перенесите их в 250 миллилитров жидкой полной среды.
Промыть грибковые гифы 500 миллилитрами 0,7 молярного раствора натрия хлорида. Затем соберите грибковый myceliUM и взвесьте его. Добавьте примерно один миллилитр раствора фермента лизиса на один грамм грибкового мицелия.
Поместите гифы для нарезки при 28 градусах Цельсия в течение трех-четырех часов с встряхиванием при 150 оборотах в минуту. Промыть нарезанные гифы 50 миллилитрами 0,7 молярного раствора натрия хлорида. Центрифугировать образец и аккуратно выбросить супернатант.
Повторно суспендировать протопласт в 20 миллилитрах 0,7 молярного раствора натрия хлорида. Добавьте 55 микролитров 37%-го формальдегида капля за каплей к двум миллилитрам буфера хлорида натрия, содержащего протопласты для сшивания до тех пор, пока конечная концентрация не сойдет на 1% Чтобы погасить непрореагидный формальдегид, добавляют 20 микролитров 10-кратного глицина в каждую пробирку. Осторожно выбросьте супернатант после центрифугирования.
Повторно суспендируют гранулу в одном миллилите 0,7 молярного раствора натрия хлорида. Тщательно отбросьте супернатант после центрифугирования и повторно суспендрите гранулу в 750 микролитрах буфера RIPA. Добавьте 37,5 микролитров 20-кратного ингибитора протеазы.
Срегите хроматин ультразвуком в течение восьми минут с помощью ультразвукового гомогенизатора. После того, как образец был УЗИ сломан, выньте часть образца в качестве входных данных, содержащих всю ДНК и белок, высвобождаемые после того, как образец обработан ультразвуком. Чтобы проанализировать длину фрагментов ДНК, проводят электрофорез 1%-агарозного геля после ультразвуковой работы.
После центрифугирования перенесите центрифугированный супернатант в 1,5-миллилитрную центрифужную трубку и храните его при отрицательных 80 градусах Цельсия для последующего использования. Перед выполнением эксперимента с IP разбавьте каждый образец хроматина до соотношения один к 10 с помощью буфера RIPA в один раз. Пипетка 50 микролитров супер парамагнитных белковых шариков в двухмиллилитровую центрифужную трубку.
Поместите трубки на магнитную подставку и дайте магнитным шарикам выпасть в осадок. Затем удалите супернатант. Добавьте один миллилитр предварительно охлажденного один раз буфера RIPA в трубку и трижды промыть суперпарамагнетические белковые шарики.
Поместите трубки на магнитную подставку и извлеките супернатант. Добавьте 100 микролитров одного буфера RIPA в каждую трубку. Добавьте в пробирку 30 микролитров образца хроматина, 100 микролитров суперпарамагнетических белковых шариков и четыре микролитра антитела H3K4me3, хорошо перемешав их.
Поместите образцы на вращающийся шейкер, чтобы инкубировать их в течение ночи при четырех градусах Цельсия в 30 раз больше G.Промыть суперпарамагнитное белковое бусинчатое антитело и комплекс хроматина путем повторного размещения шариков в одном миллилитре одногократного буфера RIPA. Промыть образец одним миллилитром буфера промывки с низким содержанием соли иммунного комплекса, затем одним миллилитром буфера промывки высокосолевого иммунного комплекса. Промойте шарики одним миллилитром буфера хлорида лития и удалите надосадочный раствор.
Затем добавьте один миллилитр БУФЕРА TE в трубку. Снова поместите трубку с одним миллилитром буфера TE и удалите супернатант пипеткой. Добавьте 100 микролитров буфера элюирования в каждую трубку центрифуги.
Выполняйте элюдение при 65 градусах Цельсия в течение 15 минут. Центрифугировать в течение одной минуты при 10 000 G при четырех градусах Цельсия и собирать супернатант в новые центрифужные трубки. Добавьте восемь микролитров пяти молярных хлоридов натрия во все трубки и инкубировать при 65 градусах Цельсия в течение четырех-пяти часов или ночью, чтобы обратить вспять поперечные связи белка ДНК.
Добавьте один микролитр Рназы А и инкубировать в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Добавьте четыре микролитра протеиназы К в каждую пробирку и инкубировать при 45 градусах Цельсия в течение одного-двух часов. Добавьте 550 микролитров смеси феноформа и изоамилового спирта в трубку центрифуги.
Центрифугировать в течение 15 минут при 10 000 g и аспирировать супернатант. Добавьте в пробирку 1/10 объема трех молярных растворов ацетата натрия, 2,5 объема абсолютного этанола и три микролитра гликогена. Поместите образец в холодильник при отрицательных 20 градусах Цельсия на ночь для осадков.
На следующий день центрифугируют трубки и выбрасывают супернатант. Промыть гранулу три раза одним миллилитром свежеприготовленного 75% этанола в 10 000 раз г. Добавить 50 микролитров стерильной деионизированной воды, чтобы достаточно растворить осадок. Восстановление концов ДНК для генерации тупой концевой ДНК с помощью набора для восстановления конца ДНК и инструкций, упомянутых в текстовой рукописи.
Чтобы добавить аденину основу к трем основным концам, добавьте 30 микролитров ДНК, два микролитра воды, пять микролитров 10-кратного буфера Taq, 10 микролитров одного миллимолярного dATP и три микролитра ДНК-полимеразы Taq в 0,2 микролитра ПЦР-центрифужную трубку. Смешайте их и реагируйте в аппарате ПЦР при 72 градусах Цельсия в течение 10 минут. Выполните линкерное лигирование путем смешивания 10 микролитров ДНК, 9,9 микролитра воды, 2,5 микролитра буфера ДНК-лигазы Т4, 0,1 микролитра адаптерной олиго-смеси и 2,5 микролитра Т4-лигазы ДНК в 0,2-микролитрной ПЦР-центрифужной трубке.
Инкубируют трубку при 16 градусах Цельсия в течение четырех часов. Чтобы амплифицировать ДНК с помощью праймеров ПЦР, добавьте 10,5 микролитра ДНК, 12,5 микролитров в два раза более высокой точности мастер-микса. один микролитр ПЦР-праймера ПЭ 1,0 и один микролитр ПЦР-праймера ПЭ 2,0 к 0,2-микролитровой ПЦР-центрифужной трубке и хорошо перемешать.
Сигналы H3K4me3 мутантов делеции mobre2, mospp1 и moswd2 были значительно снижены в его функциональных целевых областях. По сравнению со штаммом дикого типа P131 сигналы обогащенного секвенирования иммунопреципитации хроматина H3K4me3 у мутантов делеции mobre2, mospp1 и moswd2 были в значительной степени снижены. После этой процедуры можно выполнить чип на чипе и чип qPCR.
Они обычно используются для скрининга последующего гена-мишени белка и изучения взаимодействия белковой ДНК в известных местах связывания генома.
