この方法は、植物病理における真菌病態の間のエピジェネティック修飾を介して候補標的遺伝子の調節の基礎となる分子メカニズムを解明するのに役立つ。クロマチン免疫沈降シーケンシング技術は、全ゲノム中のヒストンや転写因子と相互作用するDNAセグメントを効率的に検出できます。他の方法と比較して、効率と解像度を向上させることができます。
100マイクロリットルのピペットを使用して、オートミールトマトアガープレートに100マイクロリットルの液体完全培地を加えます。接種ループを使用して、野生型株のミセリアとノックアウト株を削ります。ミセリアの破片を収集し、液体完全培地の250ミリリットルにそれらを転送します。
0.7モル塩化ナトリウム溶液の500ミリリットルで真菌ヒファを洗浄します。その後、真菌菌菌を収集し、それを計量します。真菌菌糸体の1グラムあたり約1ミリリットルの溶解酵素透過液を加えます。
150 RPMで振って3〜4時間、28°Cでシラミのハイファを置きます。シラミのヒファエを0.7モル塩化ナトリウム溶液50ミリリットルで洗います。サンプルを遠心分離し、上清を慎重に捨てます。
プロトプラストを0.7モル塩化ナトリウム溶液の20ミリリットルで再懸濁する。37%ホルムアルデヒドの55マイクロリットルを加えて、最終的な濃度が1%になるまで架橋用のプロトプラストを含む塩化ナトリウム緩衝液2ミリリットルに滴下し、未反応のホルムアルデヒドをクエンチし、各チューブに10倍のグリシンの20マイクロリットルを加える。遠心後に上清を慎重に捨てます。
0.7モル塩化ナトリウム溶液の1ミリリットルにペレットを再懸濁します。遠心分離後に上澄み液を慎重に捨て、750マイクロリットルのRIPAバッファーにペレットを再び懸濁します。プロテアーゼ阻害剤の37.5マイクロリットルを20倍加えます。
超音波ホモジナイザーを使用して8分間超音波処理によってクロマチンを剪断。サンプルが超音波破断された後、サンプルが超音波処理された後に放出される全てのDNAおよびタンパク質を含む入力としてサンプルの一部を取り出す。DNA断片の長さを分析するには、超音波処理後に1%アガロースゲル電気泳動を実行します。
遠心分離後、遠心分離された上清を1.5ミリリットルの遠心管に移し、後で使用するためにマイナス80°Cで保存します。IP実験を行う前に、各クロマチンサンプルを1~10の割合に希釈し、RIPAバッファーを1倍にします。ピペット50マイクロリットルの超常磁性タンパク質ビーズを2ミリリットル遠心管に入る。
チューブを磁気スタンドに置き、磁気ビーズを沈殿させる。その後、上清を取り除く。プリ冷却したRIPAバッファーを1ミリリットルずつチューブに加え、超常磁性タンパク質ビーズを3回洗浄します。
チューブを磁気スタンドに置き、上清を取り外します。各チューブに100マイクロリットルのRIPAバッファを加えます。クロマチンサンプル30マイクロリットル、超常磁性タンパク質ビーズ100マイクロリットル、H3K4me3抗体4マイクロリットルをチューブに加え、よく混合します。
サンプルをロータリーシェーカーに置き、30倍のG.ウォッシュで摂氏4度で一晩インキュベートし、1ミリリットルのRIPAバッファーの1ミリリットルでビーズを再懸濁して超常磁性タンパク質ビーズ抗体とクロマチン複合体を洗浄します。低塩免疫複合体洗浄バッファーの1ミリリットルでサンプルを洗浄し、その後、高塩免疫複合体洗浄バッファーの1ミリリットルで洗浄します。1ミリリットルの塩化リチウムバッファーでビーズをすすいで上清を取り除きます。
次に、TE バッファーの 1 ミリリットルをチューブに追加します。TEバッファーの1ミリリットルでチューブをもう一度置き、ピペットで上清を取り除きます。各遠心チューブに溶出バッファーの100マイクロリットルを追加します。
摂氏65度で15分間溶出します。4°Cで10,000倍Gで1分間遠心分離機を、新しい遠心管に上清を集めます。すべてのチューブに5つの塩化モルナトリウムの8マイクロリットルを加え、65°Cで4〜5時間または一晩インキュベートしてDNAタンパク質のクロスリンクを逆転させます。
Rnase Aを1マイクロリットル加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。各チューブに4マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、摂氏45度で1~2時間インキュベートします。遠心管にフェナルクロロホルムとイソアミルアルコール混合物の550マイクロリットルを加えます。
遠心分離機を10,000倍Gで15分間、上清を吸引する。1/10モル酢酸ナトリウム溶液、2.5容量の絶対エタノール、3マイクロリットルのグリコーゲンをチューブに加えます。サンプルを降水のために一晩マイナス20°Cの冷蔵庫に入れます。
翌日、チューブを遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを1ミリリットルで3回洗浄し、10,000倍のG.50マイクロリットルの無菌脱イオン水を加えて沈殿物を十分に溶解させます。DNAエンド修復キットを使用して鈍いエンドDNAを生成するためにDNA末端を修復し、テキスト原稿に記載されている指示。
3つの素端にアデニンベースを追加するには、DNA30マイクロリットル、水2マイクロリットル、10倍のTaqバッファの5マイクロリットル、1ミリモルdATPの10マイクロリットル、Taq DNAポリメラーゼの3マイクロリットルを0.2マイクロリットルPCR遠心チューブに加えます。それらを混合し、10分間摂氏72度のPCRマシンで反応します。10マイクロリットルのDNA、9.9マイクロリットルの水、2.5マイクロリットルのT4 DNAリガーゼバッファー、0.1マイクロリットルのアダプターオリゴミックス、および2.5マイクロリットルのT4 DNAリガーゼを0.2マイクロリットルPCR遠心分離管に混合してリンカーライゲーションを行います。
チューブを摂氏16度で4時間インキュベートします。PCRプライマーを使用してDNAを増幅するには、10.5マイクロリットルのDNA、12.5マイクロリットルの2倍の高忠実度マスターミックスを加えます。PCRプライマーPE 1.0の1マイクロリットルとPCRプライマーPE 2.0の1マイクロリットルを0.2マイクロリットルPCR遠心分離管に混合し、よく混ぜます。
Mobre2、mospp1およびmoswd2の欠失変異体のH3K4me3シグナルは、その機能的標的領域で有意に減少した。野生型株P131と比較して、モブレ2、mospp1およびmoswd2欠失変異体における富化H3K4me3クロマチン免疫沈降シーケンシング読み取りのシグナルは大きく減少した。この手順に従って、チップオンチップとチップqPCRを実行することができます。
それらは一般に、タンパク質の下流標的遺伝子をスクリーニングし、既知のゲノム結合部位におけるタンパク質DNA相互作用を研究するために使用される。
