Наш протокол раскрывает эпигенетические маркеры для развития растений сорго и засухоустойчивости. Такое молекулярное понимание поможет разработать более эффективные решения для адаптации сельскохозяйственных культур к экстремальным климатическим условиям в будущем. Этот протокол генерирует высокой чистоты гистоны из ткани листьев сорго подходит для не-целенаправленного профилирования пост-трансляционных модификаций масс-спектрометрии.
Демонстрация процедуры будет Шадан Абдали и Таня Винклер, после бакалавра научных сотрудников из EMSL. Для начала измельчите несколько листьев сорго жидким азотом и храните их в 50-миллилитровой центрифуге при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Используйте приблизительно четыре грамма порошка листа для анализа гистонов каждого образца.
Подготовь буферы извлечения 1, 2A и 2B, как описано в рукописи текста, и добавьте таблетку ингибитора протеазы для извлечения буфера, чтобы сделать окончательную концентрацию 0.2X. Затем добавьте 20 миллилитров подготовленного буфера экстракции один в порошок сусального листа земли и аккуратно перемешайте или вихрь в течение 10 минут. Используя сетку 100, промыть фильтрованный материал дважды с двумя миллилитров буфера извлечения по одному каждый раз.
Далее, центрифуга фильтрата на 3000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию в размахивая ротором ведро гранулы клеточного мусора и больших субклеточных органелл. Одновременно подготовьте буфер экстракции 2A, добавив ингибитор протеазы к окончательной концентрации 0,4X. Откажитесь от супернатанта, не нарушая гранулы.
Затем повторно посыку гранулы в пять миллилитров подготовленного буфера извлечения 2A. Инкубировать его на льду в течение 10 минут с нежным смешивания. Центрифуга раствор на 2, 100 раз G в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию в размахивая ротором ведро гранулы мусора и ядер.
Декант супернатант тщательно, не нарушая гранулы. Подготовьте буфер экстракции 2B, добавив ингибиторы протеазы к окончательной концентрации 1X. Добавьте пять миллилитров этого подготовленного буфера в гранулы, полученные после центрифугации.
Центрифуга при 2, 100 раз G в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию в размахивая ротором ведра гранулы мусора и ядер. Одновременно подготовьте буфер лиза ядер, добавив таблетку ингибитора протеазы. Тщательно decant supernatant, не нарушая гранулы и повторно гранулы в 250 микролитров буфера лиза.
Вихрь раствор в течение 15 секунд на максимальной скорости, чтобы гомогенизировать его и повторно использовать материал. Затем sonicate его в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию и хранить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Оттепель замороженных ядер образца и добавить 750 микролитров 5%guanidine буфера.
Затем sonicate его в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию. Перенесите образец в двухми миллилитровую трубку и вращай его при 10 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Одновременно подготовь ионный обмен хроматографическим столбцом, опоясыв его двумя миллилитровами ацетонитрила и четырьмя миллилитров воды, чтобы свести к минимуму загрязнение поверхности.
Загрузите примерно от 200 до 300 микролитров слабой смолы обмена катиоцией на колонку хроматографии и дайте смоле осесть. Вымойте смолу четыре раза с буфером гуанидина и поместите трубку и колонку на лед. Положите колонку на двухмилитровую трубку сбора и загрузите супернатант из подготовленного образца медленно на кровать смолы, не нарушая смолы.
По мере того как разрешение пропускает до конца, загрузите eluent назад к верхней части колонки 6 до 8 времен для того чтобы позволить максимальную связывать к смоле. Затем загрузите два миллилитров буфера 5%гуанидина, чтобы смыть неистоновые белки с колонки. Elute histone белки с одним миллилитр 5%guanidine буфера и собирать элуент.
Очистите трехкилотонный фильтр для отсечения спином с 500 микролитров растворителя для мытья, затем разезвите оставшийся элуент с помощью предварительно очищенного спинового фильтра. Основные гистоновые белки наблюдались в определенных регионах карты функции LC-MS, что свидетельствует об успехе эксперимента. На этой репрезентативной карте показаны нетронутые полноформатные гистоны в разбитых коробках.
Карта функций LC-MS H2B и 16 kilodalton H2A proteoforms показывает, что оба имеют несколько омологов с аналогичными последовательностями, как отмечено уникальными номерами сеанса продукта. Еще одна группа Гистонов H2A без вытянутых хвостов можно увидеть. N-терминальная ацетилляция, дополнительные ацетилирования лизина и окисления метамфетамина в белках гистона H4 можно наблюдать, исследуя различия массы на карте функции LC-MS, показанной здесь.
Были определены две белковые последовательности для белков гистона H3, H3.3 и H3.2. Фрагментация диссоциации передачи электронов использовалась для генерации спектра фрагментации идентифицированной протеоформы H3.2. Ионы-предшественники и предыдущие и следующие спектры Ms1 показаны здесь с их совпадают изотопных пиков выделены фиолетовым цветом.
Пост-трансляционные изменения могут быть локализованы с помощью карты покрытия последовательности. Сравнивая относительное изобилие протеоформ, были обнаружены изменения усеченных протеоформ гистона, характерных для условий образца. C-терминальная укоренения H4 наблюдалась только в течение трех и девяти недель для некоторых образцов.
Для H3.2, N-терминал усеченные протеоформы, как правило, более обильные в неделю 10. В отличие от этого, C-терминал усеченный H3.2 были замечены в более ранних точках времени. Усеченные протеоформы H4 C-терминала были значительно более обильными в BTx642, чем в RTx430.
При попытке этого протокола, обратите пристальное внимание на цвета супернатанта и гранулы. Изменение цвета помогает выявить потенциальные проблемы в шлифовке или лизе хлоропласта. Мы надеемся, что этот надежный протокол для изоляции гистон от листьев сорго позволит эпигенетические исследования для других подобных растений.
