Обобщенный метод определения состава свободнорастворимой фенольной кислоты и антиоксидантной способности зерновых и бобовых культур. Цельные зерна, включая зерновые и бобовые, составляют существенную часть рациона человека. Их питательная значимость для человека давно признана.
Однако совсем недавно сообщалось об их антиоксидантных защитных преимуществах для здоровья. Фенольные кислоты, обнаруженные во внешних зерновых слоях злаков и семенной оболочке бобовых, способствуют антиоксидантным свойствам цельных зерен. Они удаляют свободные радикалы, которые вызывают окислительное повреждение биомолекул.
Двумя классами фенольных кислот, обнаруженных в цельных зернах, являются гидроксибензойные кислоты и гидроксикоричные кислоты. Это исследование предоставляет простой метод извлечения цельнозерновых фенольных кислот и определения их антиоксидантной способности in vitro. Используйте пять образцов цельного зерна для этого исследования: твердая пшеница, желтая кукуруза, черноглазый коровий горох, соя и красная фасоль.
Точно взвесьте 100 миллиграммов образца цельнозерновой муки непосредственно в микроцентрифужную трубку янтарного цвета емкостью два миллилитра. Темный цвет трубки помогает предотвратить воздействие на смесь света. Добавьте один миллилитр 80% водного метанола в каждую из пробирок, содержащих примеры.
Вихрь ненадолго смешать раствор метанола и образец. Обрабатывайте образцы ультразвуком в течение 60 минут, чтобы извлечь свободные растворимые фенольные соединения. Наденьте крышку на образцы на время обработки ультразвуком для дополнительной защиты от света.
После обработки ультразвуком центрифугируйте смеси в 20 000 раз G в течение пяти минут, чтобы отстойник твердых остатков, оставляя супернатант сверху. Свободные фенольные соединения будут присутствовать в супернатанте после центрифугирования. Супернатант необходимо отфильтровать перед введением в прибор ВЭЖХ.
Чтобы отфильтровать супернатант, снимите поршень шприца объемом 3 мл и прикрепите шприцевой фильтр. Фильтр должен иметь размер пор не более 0,22 мкм. Пипетка примерно 0,4 миллилитра супернатанта в верхнюю часть шприца.
Снова вставьте плунжер и протолкните жидкость через фильтр во флакон ВЭЖХ, содержащий флакон для флакона. После того, как прибор настроен для запуска метода, описанного в рукописи для анализа ВЭЖХ, загрузите флаконы в карусель, чтобы они соответствовали списку образцов. Получите ВЭЖХ-хроматограммы на 320 нанометрах и 280 нанометрах, показывающие различные пики, представляющие различные фенольные соединения.
Используя соответствующие стандартные кривые, количественно оцените гидроксикоричные кислоты на 320 нанометрах, поскольку они имеют максимальное поглощение на этой длине волны. По тому же принципу количественно оценивают гидроксибензойные кислоты на 280 нанометров. Используйте Trolox, водорастворимый аналог витамина Е, в качестве стандарта для оценки антиоксидантной способности in vitro экстрактов цельного зерна.
Точно взвесьте один миллиграмм тролокса в трубку Falcon. Растворить четырьмя миллилитрами 50% водного метанола для приготовления запасного раствора по одному миллимолю на литр, что равно 1000 мкмоль на литр. Подготовьте шесть концентраций Тролокса, которые составляют 50, 100, 200, 400, 600 и 800 микромолей на литр, чтобы построить стандартные кривые для оценки способности dpph по удалению радикалов и эквивалентной Тролоксу антиоксидантной способности, TEAC.
Аналогичным образом, подготовьте 6,25, 12,5, 25 и 50 микромолей на литр концентраций Тролокса для оценки способности поглощения кислородных радикалов, ORAC. Составьте общий объем каждой концентрации до 500 микролитров, как показано в таблице первой. Разбавьте экстракты образцов метанолом перед анализом.
Здесь экстракты желтой кукурузы и коровьего гороха разбавляли в два раза. Экстракты пшеницы и фасоли были разбавлены пять раз, в то время как экстракт сои был разбавлен метанолом в 10 раз. Взвесьте 8,23 миллиграмма ABTS в чистую, двухмиллилитровую емкость, янтарную микроцентрифужную трубку.
Затем взвесьте 1,62 миллиграмма персульфата калия в чистую, емкостью два миллилитра, янтарную микроцентрифужную трубку. Растворите каждое из взвешенных химических веществ в одном миллилитре дистиллированной воды путем вихря. В результате получается 16-миллимолярный раствор ABTS и шестимиллимолярный раствор персульфата калия.
Приготовьте исходный раствор АБТС путем смешивания растворов АБТС и персульфата калия в равных объемах. Раствор сразу же изменится на темный цвет. Дайте этой смеси инкубироваться в темноте в течение 12-16 часов.
Разбавьте исходный раствор АБТС 30 раз 200 миллимолярным фосфат-буферным физиологическим раствором с образованием рабочего раствора АБТС. Для этого добавляют 58 миллилитров 200 миллимоляров PBS к двум миллилитрам рабочего раствора ABTS. Рабочий раствор будет содержать 0,27 миллимоляра ABTS и 0,1 миллимоляра персульфата калия.
Для анализа поместите 10 микролитров каждого разбавленного экстракта в микропластину из 96 лунок. Добавить в каждую лунку 190 микролитров рабочего раствора АБТС и инкубировать в течение 60 минут. Измерьте поглощение реакционных смесей при 750 нанометрах в микропластинчатом считывателе.
Используйте стандарты Trolox в концентрациях от 100 до 800 микромолей на литр для построения калибровочной кривой. Антиоксидантный анализ DPPH требует радикально-генерирующего соединения, DPPH. Взвесьте 1,2 миллиграмма DPPH в пустую центрифужную трубку емкостью 15 миллилитров.
Растворить DPPH в метаноле для приготовления 60-микромолярного раствора. Анализ DPPH проверяет способность экстрактов образцов поглощать свободные радикалы, производимые DPPH. Добавьте пять микролитров экстракта образца в микропластинчатые колодцы.
Далее добавляют 195 микролитров 60 микромолярного метанольного раствора DPPH и инкубируют в течение 60 минут. Измерьте поглощение на 515 нанометрах. Используйте стандарты Trolox для построения калибровочной кривой.
На первом рисунке показана структура гидроксибензойных кислот, обнаруженных в цельных зернах. В этом текущем исследовании ванильная кислота была единственной идентифицированной гидроксибензойной кислотой. На рисунке два показана структура гидроксикоричных кислот, обнаруженных в цельных зернах.
В текущем исследовании в образцах были идентифицированы p-кумаровая, кофейная и феруловая кислоты. Во второй таблице показаны фенольные кислоты, идентифицированные в образцах. Как упоминалось ранее, ванильная кислота была единственной гидроксибензойной кислотой, идентифицированной в образцах.
Он был идентифицирован только в экстракте коровьего гороха. Кофейная кислота гидроксикоричной кислоты была идентифицирована только в почечных бобах, в то время как п-кумерная кислота была идентифицирована в желтой кукурузе, коровьем горохе и сое. Феруловая кислота была идентифицирована во всех образцах и была преобладающей фенольной кислотой в образцах.
Общая концентрация фенольных кислот в порядке от наибольшей к наименьшей была в порядке сои, коровьего гороха, желтой кукурузы и фасоли или эквивалента, за которыми следовала пшеница. В третьей таблице показано общее содержание фенолов и антиоксидантная способность образцов. Антиоксидантная способность включала способность DPPH поглощать радикалы, TEAC, ORAC и общую антиоксидантную способность образцов.
Общая антиоксидантная способность представляет собой сумму значений DPPH, TEAC и ORAC. Как и во второй таблице, соя имела самую высокую общую антиоксидантную способность. Тем не менее, вместо коровьего гороха, это были скорее почечные бобы, которые имели вторую по величине общую антиоксидантную способность, хотя коровий горох имел второе по величине общее содержание фенольной кислоты.
Эта аномалия связана со структурой отдельных фенольных кислот и возможным антагонистическим действием ванильной кислоты гидроксибензойной кислоты на антиоксидантное действие гидроксикоричных кислот в коровьем горохе. Это исследование пришло к выводу, что цельные зерна различаются по своему составу фенольных кислот. Среди изученных цельных зерен соя имеет наибольшее общее количество фенольных кислот и, соответственно, самую высокую антиоксидантную способность.
