Общей целью данного протокола является скрининг экспрессии множественной конструкции белковых аргининметилтрансфераз в крупномасштабном производстве для получения миллиграммового количества белка для биохимических, биофизических и структурных исследований в среде поддерживаемом, экономически эффективном режиме в покрытии платформы экспрессии S, векторной системы экспрессии бакуловируса. Д-р Алма Сеитова представит следующие шаги. Разбавьте экспоненциально растущие клетки SF9 до конечной плотности клеток 0,4 миллиона на мил в среде насекомых, свободной от сыворотки, и вылейте в резервуар стерильных реагентов.
Используйте программируемую многоканальный пипетку для посева 0,5 мил разбавленных ячеек SF9 в каждую скважину 24-скважинной пластины. Этого объема достаточно, чтобы обеспечить равномерное покрытие рабочей поверхности скважины. В то же время он не разбавляет трансфекционную смесь слишком сильно, что обеспечивает эффективность трансфекции.
Пометьте один колодец пластины только как клетку и используйте его в качестве контроля для сравнения трансфектериальной и неперераженной клетки для оценки потенциальных признаков инфекции. Инкубируют пластины при 27 градусах до тех пор, пока это не понадобится, примерно один час, чтобы позволить клеткам прикрепиться к пластинам клеточной культуры. Разбавьте хорошо смешанный трансфекционный реагент в недоставленной среде насекомых и резервуаре стерильного реагента и осторожно перемешайте в течение 10 секунд.
Используя 12-канальный пипетку, переведите 102 микролитра разбавленного реагента транзакции в стерильную пластину 96 MicroWell. Переложите 10 микролитров по 0,2 мкг на микролитр рекомбинантной бакмидной ДНК в соответствующий колодец 96-луночной пластины MicroWell и перемешайте, осторожно встряхнув, постукивая пластиной с боков. Инкубировать трансфекционную смесь в течение 15-20 минут для сложного образования.
Используя регулируемую шестиканальный пипетку, предназначенную для переноса между 96 и 24-скважинной пластиной, накладывайте трансфекционную смесь на ячейки по каплям в соответствующих колодцах трансфекционных пластин и инкубируйте в течение четырех часов при 27 градусах. Чтобы обеспечить равномерное распределение трансфекционной смеси по монослою клеток, осторожно раскачивайте пластины вперед и назад несколько раз в течение инкубационного времени. Через четыре-пять часов после трансфекции добавьте 1,5 милы безсывороточных сред насекомых.
Дополни его 10% финалом инактивированной теплом фетальной бытовой сыворотки и 1% антибиотиком и антимикотиком. Инкубировать клетки в 27-градусном инкубаторе в течение 72-96 часов. Осторожно раскачивая трансфекционные пластины один раз в день, когда это возможно.
Ищите признаки инфекции, проявивающиеся в трансфектированных клетках через 72-96 часов после трансфекции. Через четыре-пять дней после трансфекции признаки инфекции должны проявляться в трансфектированных клетках по сравнению с контрольными клетками под инвертируемым микроскопом, а исходные рекомбинантные бакуловирусы, секретируемые в среду клеточной культуры, должны быть готовы к сбору. Используйте программируемую электронную многоканальность, позволяющую одновременно проводить сбор вирусов P1, инфицирование свежезасеянных клеток SF9 при инфицировании суспензионных клеток в их 24 колодезных блоках со 150 микролитрами вирусов P1.
Раскрутите остальные коллективные вирусные запасы P1 в течение 15 минут, покройте 24 блока скважины культурой суспензии инфицированных клеток SF9 листом AirPore. Инкубируйте блок из 24 скважин при 27 градусах с встряхиванием при 245 оборотах в час в течение 72-96 часов. За четыре дня до запланированного времени производства разделите экспоненциально растущие клетки SF9 при конечной плотности клеток 2 миллиона на мил на стеклянную нить Эрленмейера с перегородками в сывороточных свободных от насекомых средах, содержащих 1% конечного антибиотика и антимикотика.
Этот шаг будет генерировать культуру суспензии инфицированных клеток насекомых и вирусов P2 в надводном питателье для заражения новых клеток в производственной партии. Добавьте соответствующие вирусы P2 и инкубирует инфицированные клетки при более низкой температуре 25 градусов, чтобы замедлить рост клеток, встряхивая при 165 оборотах в час на орбитальном шейкере одним сантиметровым ударом. За четыре дня до запланированного времени производства, посейте два литра экспоненциально растущих клеток SF9 в свободной от насекомых среде сыворотки до плотности клеток 1 миллион на мил, в 2,8-литровую колбу Fernbach shake.
Встряхните колбу при 27 градусах с встряхиванием при 150 оборотах в об/м. Ученый Эшли Хатчинсон продемонстрирует следующий протокол. Разделите четыре литра экспоненциально растущих клеток SF9 и свободных сред от сыворотки насекомых до конечной плотности клеток 4 миллиона на мил в большие пятилитровые бутылки с реагентами.
Добавьте от 10 до 12 мил суспензии культуры клеток насекомых, инфицированных бакуловирусом. Инкубируют инфицированную культуру клеток SF9 в шейкере, вытряхивая 145 оборотов в минуту при более низкой температуре 25 градусов Цельсия в течение 72-96 часов. Миллиграммовые количества нескольких рекомбинантных белков из семейства PRMT, экспрессируемых в бакуловирусе, немедленное производство в клетках SF9 используются для биохимических биофизических учебных исследований, как видно на рисунке пять.
В SGC кристаллические структуры решались в депонированном в банке белковых данных для полноразмерных или усеченных форм белков PRMT4, 6, 7 и 9 с различными химическими зондами и ингибиторами. Экспрессионные плазмиды для этих PRMT были депонированы для добавления коллекции генов SGC и доступны для исследовательского сообщества. В этом видео мы подчеркнули ключевые элементы для успешного экспедиционного скрининга их множественной конструкции белка аргининметилтрансфераз в крупномасштабном производстве в системе экспрессии бакуловируса.
Использование обычных регулируемых и программируемых многоканальных пипеток сделало весь их процесс более быстрым, чем эффективным. Использование высокоэффективных и менее токсичных для клеток реагентов трансфекции для генерации рекомбинантных вирусов привело к более экономичности и этой обработке клеток трансфекционного протокола. Заражение крупномасштабной партии для производства белка культурой суспензии бакуловируса, инфицированной в шести клетках, значительно уменьшало трудозатраты на трудоемком этапе в жизненно важной амплификации стартера.
Это, например, центрифугирование этого специальной культурой инфицированных клеток. Это, конечно, в исключении дополнительной обработки инфицированных клеток в избегание в их более плотной деградации вируса. Поддержание клеток культуры суспензии культуры в этом масштабе производства в культурном сосуде было большим полевым объемом, что помогло нам преодолеть ограничение объема производства и принять крупномасштабную платформу.
Это очень полезно для лабораторий, не имеющих доступа к биореакторам или ограниченного пространства в производственном конвейере. Хотя наш протокол был описан для белков семейства белков аргининметилтрансфераз, тот же подход может быть применен к любому другому семейству белков, требующих платформы экспрессии для получения достаточного количества их белка для биохимических биофизических учебных исследований.
