Bu protokolün genel amacı, S, baculovirus ekspresyon vektör sisteminin kapsama alanında orta destekli, uygun maliyetli modda biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalar için proteinin miligram miktarını elde etmek için büyük ölçekli üretimde protein arginin metiltransfezelerinin birden fazla yapının ekspresyon taramasıdır. Dr. Alma Seitova aşağıdaki adımları sunacaktır. Katlanarak büyüyen SF9 hücrelerini serumsuz böcek ortamlarında mil başına 0,4 milyon nihai hücre yoğunluğuna seyreltin ve steril reaktif rezervuarına dökün.
Seyreltilmiş SF9 hücrelerinin 24 kuyu plakasının her kuyusuna 0,5 mil tohumlamak için programlanabilir çok kanallı bir pipet kullanın. Bu hacim, kuyunun çalışma yüzeyinin eşit olarak kapsamasını sağlamak için yeterlidir. Aynı zamanda, transfeksiyon karışımını çok fazla seyreltmez, bu da transfeksiyon verimliliği sağlar.
Plakanın bir kuyuyu sadece hücre olarak etiketle ve potansiyel enfeksiyon belirtilerini değerlendirmek için transfected ve transfected olmayan hücrenin karşılaştırılması için bir kontrol olarak kullanın. Hücrelerin hücre kültürü plakalarına bağlanmasına izin vermek için plakaları ihtiyaç duyulana kadar 27 derecede, yaklaşık bir saat kuluçkaya yaslayın. İyi karıştırılmış transfeksiyon reaktifini, desteklenmemiş böcek ortamında ve steril bir reaktif rezervuarında seyreltin ve 10 saniye boyunca hafifçe karıştırın.
12 kanallı pipet kullanarak, seyreltilmiş işlem reaktifinin 102 mikrolitresini steril bir 96 MicroWell plakasına aktarın. Rekombinant bacmid DNA'sının mikrolitresi başına 0,2 mikrogramlık 10 mikrolitreyi 96 kuyu microWell plakasının ilgili kuyusuna aktarın ve plakayı yanlardan dokunarak hafifçe sallayarak karıştırın. Karmaşık bir oluşum için transfeksiyon karışımını 15 ila 20 dakika kuluçkaya bırakın.
96 ve 24 kuyu plakası arasında aktarım için tasarlanmış ayarlanabilir altı kanallı pipet kullanarak, transfeksiyon karışımını transfeksiyon plakalarının karşılık gelen kuyularında damla açısından hücrelere bindirin ve 27 derecede dört saat kuluçkaya yatırın. Transfeksiyon karışımının hücrelerin monolayer üzerinde eşit dağılımını sağlamak için, kuluçka süresi boyunca plakaları birkaç kez hafifçe ileri geri sallayın. Transfeksiyon süresinden dört ila beş saat sonra, 1,5 mil serumsuz böcek ortamı ekleyin.
Isı inaktive fetal sığır serumu ve% 1 antibiyotik ve antimycotic% 10 finali ile destekleyin. Hücreleri 27 derecelik bir inkübatörde 72 ila 96 saat kuluçkaya yatır. Mümkün olduğunda transfeksiyon plakalarını günde bir kez hafifçe sallayın.
Transfeksiyon sonrası 72 ila 96 saatte transktaklı hücrelerde belirgin enfeksiyon belirtileri arayın. Transfeksiyondan dört ila beş gün sonra, transfeksiyon hücrelerinde ters mikroskop altındaki kontrol hücrelerine kıyasla enfeksiyon belirtileri belirgin olmalı ve hücre kültürü ortamına salgılanan ilk rekombinant baculovirüsler toplanmaya hazır olmalıdır. P1 virüslerinin toplanmasına, 24 kuyu bloğundaki süspansiyon hücrelerinin enfeksiyonunda taze tohumlu SF9 hücrelerinin enfeksiyonuna ve 150 mikrolitre P1 virüslerine izin vermek için programlanabilir bir elektronik çok kanallı kullanın.
Toplu P1 viral stoklarının geri kalanını 15 dakika boyunca aşağı çevirin, enfekte SF9 hücrelerinin süspansiyon kültürüne sahip 24 kuyu bloğuna bir AirPore sayfası ile örtün. 24 kuyu bloğunu 27 derecede kuluçkaya yatırın ve 72 ila 96 saat boyunca 245 RPM'de sallanın. Planlanan üretim süresinden dört gün önce, katlanarak büyüyen SF9 hücrelerini, mil başına 2 milyonluk son hücre yoğunluğunda, %1 nihai antibiyotik ve antimycotic içeren serumsuz böcek medyasındaki şaşkınlıklarla Erlenmeyer cam sallama diş ipi olarak ikiye bölün.
Bu adım, üretim partisindeki yeni hücrelerin enfeksiyonu için süpernatanttaki enfekte böcek hücrelerinin ve P2 virüslerinin süspansiyon kültürünü üretecektir. İlgili P2 virüslerini ekleyin ve hücre büyümesini yavaşlatmak için enfekte olmuş hücreleri 25 derece daha düşük sıcaklıkta kuluçkaya yatırın, bir inç vuruşla yörüngesel bir çalkalayıcıda 165 RPM'de sallayın. Planlanan üretim zamanından dört gün önce, Tohum iki litre katlanarak büyüyen SF9 hücreleri böcek serumu ücretsiz ortamda mil başına 1 milyon hücre yoğunluğuna, 2.8 litre Fernbach sallama şişesinde.
Matarayı 27 derecede 150 RPM'de sallayarak sallayın. Katlanarak büyüyen dört litre SF9 hücresini ve böcek serumu içermeyen ortamı, mil başına 4 milyonluk son hücre yoğunluğuna büyük beş litre reaktif şişelere bölün.
Baculovirüs enfekte böcek hücrelerinin süspansiyon kültüründen 10 ila 12 mil ekleyin. SF9 hücrelerinin enfekte kültürünü, 72 ila 96 saat boyunca 25 santigrat derece daha düşük bir sıcaklıkta 145 RPM sallayan bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. SF9 hücrelerinde baculovirüs hemen üretiminde PRMT ailesinin ekspresinden elde edilen birkaç rekombinant proteinin miligram miktarları, şekil beşte de görülebileceği gibi biyokimyasal biyofiziksel öğretim çalışmaları için kullanılmaktadır.
SGC'de kristal yapılar, çeşitli kimyasal prob ve inhibitörlerle PRMT4, 6, 7 ve 9 proteinlerinin tam uzunluğu veya kesilmiş formları için protein veri bankasına yatırıldı. Bu PRMT'ler için ekspresyon plazmidleri SGC tarafından gen toplama eklemek için biriktirildi ve araştırma topluluğunun kullanımına sunuldu. Bu videoda, baculovirüs ekspresyon sistemindeki büyük ölçekli üretimde protein arginin metiltransfenazlarının çoklu yapılarının başarılı bir şekilde taranması için temel unsurları vurguladık.
Düzenli ayarlanabilir ve programlanabilir çok kanallı pipetlerin kullanımı, tüm işlemlerini verimli olmaktan daha hızlı hale getirdi. Hücreler için yüksek performanslı ve daha az hücre toksik kullanımı, rekombinant virüslerin üretimi için transfeksiyon reaktifi daha uygun maliyetli ve bu hücre işleme transfeksiyon protokolüne yol açmıştır. Protein üretimi için büyük ölçekli partinin altı hücrede enfekte olan baculovirüs süspansiyon kültürü ile enfeksiyonu, hayati başlangıç amplifikasyonunda zaman alıcı adımda emekleri önemli ölçüde azalttı.
Örneğin, bunu enfekte hücrelerin özel kültürüyle santrifüj etmektir. Bu tabii ki, virüs bozulmasında daha sıkı olmamak için enfekte hücrelerin ekstra kullanımı hariç tabii ki. Süspansiyon kültürü kültür hücre bakımı bu ölçekte kültür gemisinde üretim yüksek alan hacmi, üretim hacminin sınırlandırılmasının üstesinden gelmemize ve büyük ölçekli bir platform benimsememize yardımcı oldu.
Bu, biyoreaktörlere erişimi olmayan veya üretim boru hattında sınırlı alana sahip laboratuvarlar için son derece yararlıdır. Her ne kadar protokolümüz protein arginin metiltransfenazes ailesinin proteinleri için tanımlanmış olsa da, biyokimyasal biyofizik öğretim çalışmaları için proteinlerinin yeterli miktarda elde edilmesi için ifade platformu gerektiren diğer protein ailesine de aynı yaklaşım uygulanabilir.
