O objetivo geral deste protocolo é a triagem de expressão de múltiplos construtos de metiltransferases de arginina proteica na produção em larga escala para obter a quantidade de miligrama da proteína para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais no modo médio suportado e econômico na cobertura da plataforma de expressão S, sistema vetorial de expressão baculovirus. Alma Seitova apresentará os seguintes passos. Diluir as células SF9 em crescimento exponencial para a densidade celular final de 0,4 milhões por mil na mídia de insetos sem soro, e despeje no reservatório de reagentes estéreis.
Use uma pipeta multicanal programável para semear 0,5 mil das células SF9 diluídas em cada poço da placa de 24 poços. Este volume é suficiente para garantir até mesmo a cobertura da superfície de trabalho do poço. Ao mesmo tempo, não dilui muito a mistura de transfecção, o que permite a eficiência da transfecção.
Rotule um poço da placa apenas como célula, e use-o como controle para a comparação da célula transfecida e não transfecida para avaliar possíveis sinais de infecção. Incubar as placas a 27 graus até que seja necessário, aproximadamente uma hora, para deixar as células se prenderem às placas de cultura celular. Diluir reagente de transfecção bem misturado no meio de inseto não espartilado e um reservatório de reagente estéril, e misturar suavemente por 10 segundos.
Usando uma pipeta de 12 canais, transfira 102 microliters do reagente de transação diluído em uma placa MicroWell estéril. Transfira 10 microliters de 0,2 microgramas por microlitra de DNA bacmídeo recombinante para o poço correspondente da placa MicroWell de 96 poços e misture tremendo suavemente, tocando a placa pelos lados. Incubar a mistura de transfecção por 15 a 20 minutos para uma formação complexa.
Usando uma pipeta de seis canais ajustável projetada para a transferência entre uma placa de 96 e 24 poços, sobreponha a mistura de transfecção sobre as células em termos de gota em poços correspondentes das placas de transfecção, e incubar por quatro horas a 27 graus. Para garantir a distribuição uniforme da mistura de transfecção sobre a monocamada das células, balance suavemente as placas para frente e para trás várias vezes durante o tempo de incubação. Quatro a cinco horas após o tempo de transfecção, adicione 1,5 mil de mídia de insetos sem soro.
Suplementá-lo com 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor e 1% antibiótico e antimíctico. Incubar células em uma incubadora de 27 graus por 72 a 96 horas. Balance suavemente as placas de transfecção uma vez por dia, quando possível.
Procure sinais de infecção evidentes em células transfeinadas entre 72 e 96 horas após a transfecção. Quatro a cinco dias após a transfecção, os sinais de infecção devem ser evidentes nas células transfeccionadas em comparação com as células de controle sob um microscópio invertido, e os baculovírus recombinantes iniciais secretados no meio de cultura celular devem estar prontos para coletar. Use um multicanal eletrônico programável para permitir simultaneamente a coleta de vírus P1, a infecção de células SF9 recém-semeadas na infecção de células de suspensão em seus 24 blocos de poços com 150 microliters dos vírus P1.
Gire o resto dos estoques virais P1 coletivos por 15 minutos, cubra os 24 blocos de poços com cultura de suspensão das células SF9 infectadas com uma folha airpore. Incubar o bloco de poços 24 a 27 graus com agitação em 245 RPMs por 72 a 96 horas. Quatro dias antes do tempo de produção programado, dividiu exponencialmente as células SF9, a uma densidade celular final de 2 milhões por mil em erlenmeyer de vidro shake fio dental com defleções em mídia de insetos livres de soro contendo antibiótico 1% final e antimíctico.
Esta etapa gerará cultura de suspensão de células de insetos infectados e vírus P2 no supernante para a infecção de novas células no lote de produção. Adicione os vírus P2 correspondentes e incuba as células infectadas na temperatura mais baixa de 25 graus para retardar o crescimento celular, tremendo a 165 RPMs em um agitador orbital com um curso de uma polegada. Quatro dias antes do tempo de produção programado, semente dois litros de células SF9 que crescem exponencialmente em mídia livre de soro de insetos para a densidade celular de 1 milhão por mil, no frasco de 2,8 litros fernbach shake.
Agite o frasco a 27 graus com tremor a 150 RPMs. A cientista ashley Hutchinson demonstrará o seguinte protocolo. Divida quatro litros de células SF9 em crescimento exponencial e mídia livre de soro de insetos para a densidade celular final de 4 milhões por mil nas grandes garrafas de reagente de cinco litros.
Adicione 10 a 12 mil da cultura de suspensão das células de insetos infectadas pelo baculovírus. Incubar a cultura infectada das células SF9 em um shaker sacudindo 145 RPM a uma temperatura mais baixa de 25 graus Celsius por 72 a 96 horas. Quantidades de miligramas de várias proteínas recombinantes da família PRMT expressas na produção imediata de baculovírus em células SF9 são usadas para estudos bioquímicos biofísicos instrucionais, como pode ser visto na figura cinco.
No SGC, as estruturas cristalinas foram resolvidas no banco de dados de proteínas para as formas de comprimento total ou truncadas das proteínas PRMT4, 6, 7 e 9 com várias sondas químicas e inibidores. Os plasmídeos de expressão desses PRMTs foram depositados para adicionar coleta genética pelo SGC e estão disponíveis para a comunidade de pesquisa. Neste vídeo, enfatizamos elementos-chave para a triagem bem-sucedida da expedição de sua construção múltipla das metiltransferases de arginina proteica na produção em larga escala no sistema de expressão de baculovírus.
O uso das pipetas multicanais ajustáveis e programáveis regulares, tornou todo o seu processo mais rápido do que eficiente. O uso de células tóxicas de alto desempenho e menos células para as células, reagente de transfecção para a geração de vírus recombinantes levou a um protocolo de transfecção mais econômico e este protocolo de transfecção de manuseio celular. A infecção do lote em larga escala para produção de proteínas com cultura de suspensão de baculovírus infectado em seis células reduziu significativamente os trabalhos em etapa demorada na amplificação vital da partida.
É, por exemplo, centrifugando isso com cultura especial de células infectadas. Isso é, naturalmente, em excluir o manuseio extra das células infectadas em evitar em sua mais apertada na degradação do vírus. A manutenção da célula de cultura de cultura de suspensão nesta escala de produção no navio de cultura foi de alto volume de campo nos ajuda a superar a limitação do volume de produção e adotar uma plataforma em larga escala.
Isso é altamente útil para os laboratórios sem acesso aos bioreatores ou espaço limitado no pipeline de produção. Embora nosso protocolo tenha sido descrito para as proteínas da família de metilatransferases de proteína arginina, a mesma abordagem pode ser aplicada a qualquer outra família de proteínas que exija plataforma de expressão para obter uma quantidade suficiente de sua proteína para estudos bioquímicos biofísicos instrucionais.
