Метод профилирования рибосом, также называемый RIBO-seq, в настоящее время является наиболее эффективным инструментом для изучения процесса синтеза белка in vivo. Преимуществом этого метода является его способность контролировать трансляцию путем точного отображения положения и количества рибосом. RIBO-seq основан на том, что рибосома, связываясь с молекулой мРНК, защищает погребенный фрагмент транскрипта при переваривании рибонуклеазы.
Полученные фрагменты, называемые рибосомными следами, могут быть секвенированы и нанесены на транскрипт, из которого они произошли, что приводит к определению точного положения рибосом. Одновременно с RIBO-seq выполняется высокопроизводительное общее секвенирование мРНК, чтобы обеспечить точку отсчета и позволить сравнивать данные как RIBO-seq, так и RNA-seq во время анализа данных. Перед сбором клеток вы можете дополнительно добавить хлорамфеникол в бактериальную культуру, до конечной концентрации 100 микрограммов на миллилитр, чтобы ингибировать трансляцию.
Инкубировать культуру с антибиотиком в течение одной минуты. Этот шаг важен, если сбор урожая занимает больше времени, чем обычно, так как ингибирование трансляции позволяет продлить время сбора проб. Соберите образцы с помощью предварительно нагретой системы фильтрации.
Вы можете ввести встряхивание, чтобы имитировать условия роста. Прекратите фильтрацию, когда все среды прошли через мембрану, но не дайте фильтру полностью высохнуть. Собирайте бактериальные гранулы, быстро соскребая клетки с фильтрующего диска с помощью предварительно подогретой, продезинфицированной совки.
Немедленно поместите всю мерную ложку с собранными клетками в 50-миллилитровую трубку, заполненную жидким азотом. Заготовленная гранула должна быть полностью покрыта жидким азотом. Дайте грануле тщательно замерзнуть и вытесните замороженные клетки с помощью предварительно охлажденный совок.
Закройте крышку и убедитесь, что она проколота. Это важно, так как жидкий азот может привести к взрыву закрытых контейнеров из-за изменения давления при испарении. Приготовьте GMPP, ДНК-тампон и свежие трубки Eppendorf, предназначенные для лизазы.
При необходимости готовят буфер лизиса с добавлением хлорамфеникола. Выделите 500 микролитров лизисного буфера на образец в отдельные пробирки Эппендорфа и поместите их на лед. Обеззаражить раствор и пестик лабораторным дезинфицирующим средством и 70% этанолом.
Охладите раствор и пестик, налив в раствор жидкий азот. Переложите замороженные бактериальные гранулы в предварительно охлажденный раствор и измельчите его в порошок. Добавьте примерно один объем оксида алюминия и продолжайте измельчение.
Держите раствор, пестик и клетки в прохладном, заливая жидким азотом, когда это необходимо, чтобы не дать содержимому раствора оттаять. Непосредственно перед использованием добавьте GMPPNP и мазок ДНК в буферную аликвоту лизиса. Переложите раствор в раствор и продолжайте измельчение.
Дайте лизазе медленно оттаить во время измельчения. Когда лизаза полностью оттает, переложите смесь в предварительно охлажденный трубку Эппендорфа и верните в лед. Центрифужная лизаза при 20 0000 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Переложите супернатанты в свежие, предварительно охлажденные трубки Эппендорфа и поместите их на лед. Измерьте концентрацию РНК в каждом разбавленном образце с помощью NanoDrop. Разделите каждый лисат на две части, от 0,5 до 1 миллиграмма РНК для RIBO-seq, а остальное для RNA-seq.
К одному миллиграмму РНК добавляют 3,8 микролитра МНазы в Tris pH 8 и доливку буфером лизиса до общего объема 500 микролитров. Инкубировать при 25 градусах Цельсия, 300 выстрелов в минуту, в течение 45 минут. Когда инкубация будет завершена, очистите образцы с помощью коммерчески доступного набора для очистки РНК.
Приготовьте 15%-ный полиакриламидный гель TBE с восемью молярными мочевинами и поместите его в резервуар с буфером TBE. Предварительный запуск в течение минимум 10 минут при постоянном напряжении 200 вольт. Смешайте образцы с буфером образцов TBE-мочевины.
Денектюр при 95 градусах Цельсия в течение одной минуты и поместите их сразу на лед. Вымойте мочевину, введя буфер TBE в гелевые колодцы с помощью шприца. Загрузите образцы, оставив одно пространство между ними, чтобы отделить каждый образец и предотвратить перекрестное загрязнение.
Используйте 29 нуклеотидов длинного олиго и смесь 26 и 32 нуклеотидов длинных олиго в качестве маркеров. Запустите электрофорез при постоянном напряжении 180 вольт. Подготовьте стерильный буфер для ночной инкубации.
После завершения электрофореза окрасить гель SYBR Gold. Иссейте фрагменты геля между 26 и 32 нуклеотидами стерильной иглой или лезвием бритвы и поместите фрагменты геля в отдельные трубки Эппендорфа. Замените иглу или лезвие бритвы между образцами.
Добавьте 200 микролитров ночного инкубационного буфера к каждому Эппендорфу и инкубирует образцы при 10 градусах Цельсия, 1000 выстрелов в минуту, в течение ночи. На следующий день очистите образцы с помощью набора для очистки РНК и элюйте их в 18 микролитрах воды без нуклеазы. Полученные рибосомные следы готовы к библиотечной подготовке.
Выполнить истощение рибосомной РНК для образцов для РНК-seq с использованием коммерчески доступного набора. Затем очистите образцы с помощью комплекта для очистки РНК. Выполните щелочной гидролиз следующим образом; подготовьте щелочной гидролизный буфер, добавьте один объем буфера к одному объему образца и инкубируете при 95 градусах Цельсия в течение 25 минут.
Добавьте пять микролитров 3 моляра ацетата натрия рН 5,5 к каждому образцу, чтобы остановить реакцию. Очистите образцы с помощью набора для очистки РНК и проейте их в 18 микролитрах воды без нуклеазы. Полученная случайно фрагментированная РНК готова к подготовке библиотеки.
Добавьте 10 микролитров 10-кратного реакционного буфера и пять микролитров полинуклеотидкиназы Т4 к каждому образцу. Насиживать при 37 градусах Цельсия в течение полутора часов. По истечении этого времени добавляют три микролитра одного миллимоляра АТФ и инкубируют при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.
Затем очистите образцы с помощью комплекта для очистки РНК. Выполните подготовку библиотеки с помощью коммерчески доступного комплекта, в соответствии с протоколом, представленным здесь. Выполняйте PAGE с использованием 6% полиакриламидного геля.
Окрась гель золотом SYBR. Фрагменты акцизного геля, содержащие библиотеки. Для образцов RNA-seq библиотека составляет от 135 до 180 нуклеотидов, а для RIBO-seq - от 135 до 170 нуклеотидов.
Используйте стерильные иглы или бритвенные лезвия и поместите иссеченные фрагменты геля в отдельные трубки Эппендорфа. Не забудьте поменять иглу или лезвие бритвы между образцами. Добавьте 100 микролитров воды без нуклеазы к каждому иссеченному фрагменту геля.
И высиживают их при 10 градусах Цельсия, 450 выстрелов в минуту, на ночь. На следующий день очистите образцы с помощью набора для очистки ДНК. Полученные библиотеки готовы к контролю качества и количества с высокой чувствительностью, электрофорезу ДНК на кристалле, а затем к секвенированию следующего поколения.
Полученные библиотеки кДНК представляют соответствующее количество и качество, необходимые для секвенирования следующего поколения, что подтверждается высокочувствительным электрофорезом ДНК на кристалле. Полосы и пики, представляющие библиотеки RIBO-seq, более узкие и лучше определены, по сравнению с тем, что представляют библиотеки RNA-seq. Согласно микросхеме электрофореза, библиотеки имеют ожидаемую линзу.
Дополнительные пики, близкие к 200 парам оснований, присутствующим в библиотеках RIBO-seq, могут указывать на спящие рибосомы, не полностью переваренные рибосомные следы или артефакты, например, рРНК, и могут быть отброшены во время биоинформатического анализа, когда данные, полученные в результате секвенирования, обрезаются и рРНК-тРНК фильтруется. Среднее количество кДНК, генерируемой при подготовке библиотеки, составляет 32 нанограмма, что обеспечивает достаточное количество материала, необходимого для секвенирования следующего поколения. После контроля качества с помощью микросхеменного электрофореза библиотеки были извлечены для секвенирования одной и 50 пар оснований на платформе NextSeq 500 от Illumina.
Обрезка адаптеров и некачественных последовательностей привела к 25-47 миллионам считывания на образец для образцов RNA-seq и от 25 до 50 миллионов считывания на образец для образцов RIBO-seq. Полученные данные были проверены контролем качества с помощью FastQC. Образцы RNA-seq и RIBO-seq представили очень хорошее качество.
Картирование библиотек, подготовленных в соответствии с описанным протоколом, дало от 2,4 до 9,6 миллиона уникально отображенных считывания на образец для образцов RNA-seq и от 2,3 до 10,4 миллиона уникально отображенных считывания для образцов RIBO-seq. Данные RIBO-seq демонстрируют тройную периодичность и высокий, узкий пик, соответствующий инициирующим рибосомам и характерный для рибосомных следов, чего не наблюдается в данных RNA-seq. Более того, график, показывающий профили среднего покрытия рибосомных следов и фрагментов мРНК на кодирующих последовательностях, показывает более высокую долю считывания, сопоставленных с CDS в наборе данных RIBO-seq, как и ожидалось.
Визуализация нанесенных на карту рибосомных следов показала очень похожие закономерности по сравнению с результатами, полученными в результате того же эксперимента, выполненного в соответствии со стандартной процедурой RIBO-seq, которая включает восстановление моносом путем ультрацентрифугирования градиента сахарозы. Наш протокол использовался для исследования регуляции трансляции в различных условиях роста, но может быть применен для изучения других аспектов трансляции, таких как обнаружение сайтов инициации трансляции и новых генов, кодирующих белки. Секвенирование библиотек, подготовленных в соответствии с нашими руководящими принципами, приводит к получению достаточных данных для всестороннего биоинформатического анализа.
Протокол, который мы представляем здесь, является быстрым, простым и экономичным и может быть выполнен со стандартным лабораторным оборудованием.
