Малая РНК регулирует многие биологические процессы. Поэтому важно разработать чувствительные и беспристрастные методы их обнаружения. Наш протокол протокол предусматривает шаги вперед к этой цели.
Наш протокол страдает от меньшего количества проблем с предвзятостью, чем классические методы присвоения библиотеки РНК, и, что важно, он позволяет более чувствительные обнаружения двух зубцов или мезо-РНК. Такие как растительные микро-РНК. После извлечения общей РНК в соответствии со стандартными протоколами.
Предварительно запустите 15%TBE мочевины гель в течение пятнадцати минут на 200 вольт. И смешать пять-двадцать микрограммов общей РНК, в пять-пятнадцать микролитер объем, с равным объемом формамида загрузки красителя в 200 микролитровой трубки. Через пять минут при 65 градусах Цельсия, в термоциклере с нагретой крышкой, немедленно поместите трубки на лед и загрузите последний и накройте гель хотя бы одной полосой между ними.
Затем запустите гель на 200 вольт, пока бромофенол мигрировал около двух третей длины геля. Чтобы загрузить РНК, сначала проколоть дно нуклеазы бесплатно 0,5 миллилитров микро центрифуги трубки, с 21 калибровочных иглы, и поместите проколотую трубку в нуклеазы бесплатно круглые два миллилитров микро центрифуги трубки. Далее, инкубировать гель при комнатной температуре с нуклеиновой кислотой гель пятно в воде в течение десяти-пятнадцати минут, прежде чем просматривать гель на трансиллюминатор.
Вырежьте образец РНК между 17 и 29 нуклеотидных полос лестницы, и передать гель кусок в проколотую трубку. Спин вниз гель в микро центрифуге на максимальной скорости в течение двух минут, и удалить 0,5 миллилитров трубки, которая теперь должна быть пустой. Добавьте 300 микролитров нуклеазы бесплатно 0,3 моляров хлорида натрия в измельченный гель, и поместите трубку на ротатор, по крайней мере два часа при комнатной температуре.
В конце конца инкубации перенесите измельченную гелевую суспензию на спиновую колонку и центрифугу на две минуты на максимальной скорости в микро центрифуге. Для нелигированной три основных ликвидации адаптера, тщательно смешать десять микролитров нуклеазы свободной воды с извлеченным образцом РНК, и добавить шесть микролитров из трех моляров ацетата натрия с смешиванием. Добавьте в образец 40 микролитров шариков магнитной очистки и 60 микролитров изопропанола с тщательным смешиванием.
И инкубировать подвеску в течение пяти минут при комнатной температуре. В конце инкубации поместите образец на магнитную стойку, пока раствор не станет ясным. Удалите чистый супернатант и добавьте в бисер 180 микролитров свежеприготовленного 80%этанола.
Через 30 секунд снимите этанол и ненадолго закрути трубку. Удалите остатки жидкости, которые, возможно, собраны в нижней части трубки, и позволить бисеру высохнуть в течение двух минут, прежде чем повторно приостановить образец в 22 микролитров 10 миллимоляров Tris. Через две минуты намагнителизируйте образец до тех пор, пока раствор не окажется ясным.
Затем смешайте 20 микролитров ясного супернатанта с шестью микролитерами из трех ацетата натрия в новой трубке и добавьте 40 микролитров магнитных бусин и 60 микролитров 100%изопропанола. Через пять минут при комнатной температуре намагничйте образец до тех пор, пока раствор не появится ясным, прежде чем удалить супернатант. Обработать образец с 180 микролитров свежеприготовленных 80% этанола в течение 30 секунд, прежде чем удалить этанол спиннинг вниз образца, и удаление любой остаточной жидкости, которая накопилась в нижней части трубки.
После того, как шарики высохнут в течение двух минут, повторно приостанавливайте их в 10 микролитров нуклеазной свободной воды в течение двух минут, прежде чем намагничить образец до тех пор, пока раствор не станет ясным. Затем перенесите девять микролитров супернатанта в новую трубку и добавьте в образец один микролитер буфера РНК-лигазы T4 и один ммиколитер воды. Для очистки геля, запустить пять, десять и двадцать микролитров продукта ПЦР на родной 6%TBE гель в течение одного часа.
Инкубировать завершенный гель с нуклеиновой кислотой гель пятно в воде в течение десяти-пятнадцати минут, и просматривать гель на трансиллюминатор, чтобы добыча 150 базовых пар библиотечной полосы. Поскольку трудно изолировать 150 базовых пар полос, представляющих их, это наша библиотека, из-за наличия тесно мигрирующих побочных продуктов вам нужно будет сократить гель очень тщательно. Затем изолировать РНК, как только что продемонстрировали.
Для изменения файла необработанной последовательности загрузите файлы последовательности fastq, генерируемые во время секвенирования, и при необходимости преформируете демултиплексирование с bcl2fastq2. Удалите последовательности адаптеров с помощью cutodapt и используйте команду, как это было продемонстрировано. Используйте seqtk, как указано для удаления терминальных случайных нуклеотидов в последовательностях читает.
Затем используйте команду awk, как указано, чтобы отбросить последовательности короче 10 нуклеотидов. Чтобы сопоставить обрезанные последовательности, откройте miRBase и загрузите зрелый файл fa. Используйте команду, как указано, чтобы заменить остатки U с остатками T, чтобы дать полный список всех микро РНК в базе данных, происходящих из различных организмов.
Выберите микро-РНК последовательности организма, представляющих интерес, с командой, как указано, и карта читает файл с помощью bowtie2, не допуская несоответствий. Используйте инструмент для выравнивания последовательностей читает в базу данных, требуя, чтобы читать карты полностью микро РНК базы данных, с любыми несоответствиями, как указано. Затем используйте команду, чтобы отбросить чтения, которые не выравниваются.
После загрузки увеличения количества ПЦР усиленная библиотека на гель, как попродемонстрировано, продукты, соответствующие ожидаемому размеру могут быть извлечены. После элюции очищенную библиотеку можно проверить на чипе электрофореза капиллярного геля. В дополнение к ожидаемым 150 базовых парных продуктов, и увеличение доли 130 базовых пар видов, соответствующих адаптер димеры, как правило, наблюдается как увеличение количества продукта ПЦР загружаются.
Аналогичные результаты получаются, когда библиотеки из смеси синтетических малых РНК готовятся с использованием реагентов из комплектов или других принадлежностей. Для сравнения показаны ранее опубликованные результаты для той же небольшой смеси РНК. Здесь показано сравнение выполнения протокола TS5 со стандартным протоколом TS для обнаружения неизмененных и двух основных микро-РНК O-methal.
Было также протестировано обнаружение двух основных модифицированных пиРНК O-метала в образцах человека. Как отмечается, TS5 преформируется значительно лучше, чем ТС для обнаружения двух основных O-метхальных РНК, но не для неизмененных РНК. Подготовка библиотек репликации для каждого образца в разные даты.
Обычно между репликациями, сделанными одновременно, практически нет различий, или между библиотеками, подготовленными в разные даты, могут быть существенные различия.
