Die Ribosomen-Profiling-Technik, auch RIBO-seq genannt, ist derzeit das effektivste Werkzeug, um den Prozess der Proteinsynthese in vivo zu untersuchen. Der Vorteil dieser Methode ist ihre Fähigkeit, die Translation zu überwachen, indem die Position und Anzahl der Ribosomen genau abgebildet wird. RIBO-seq basiert auf der Tatsache, dass das Ribosom durch die Bindung an das mRNA-Molekül das vergrabene Fragment des Transkripts bei der Ribonuklease-Verdauung schützt.
Die erhaltenen Fragmente, ribosomale Fußabdrücke genannt, können sequenziert und auf das Transkript abgebildet werden, aus dem sie stammen, was zur Bestimmung der genauen Position der Ribosomen führt. Gleichzeitig mit dem RIBO-seq wird eine Hochdurchsatz-Gesamt-mRNA-Sequenzierung durchgeführt, um einen Bezugspunkt zu bieten und den Vergleich von Daten aus RIBO-seq und RNA-seq während der Datenanalyse zu ermöglichen. Vor der Zellernte können Sie der Bakterienkultur optional Chloramphenicol bis zur Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter hinzufügen, um die Translation zu hemmen.
Inkubieren Sie die Kultur mit dem Antibiotikum für eine Minute. Dieser Schritt ist wichtig, wenn die Ernte länger als üblich dauert, da die Translationshemmung eine Verlängerung der Probensammelzeit ermöglicht. Sammeln Sie die Proben mit einem vorgewärmten Filtersystem.
Sie können Schütteln einführen, um Wachstumsbedingungen nachzuahmen. Stoppen Sie die Filterung, wenn alle Medien die Membran passiert haben, aber lassen Sie den Filter nicht vollständig trocknen. Sammeln Sie Bakterienpellets, indem Sie die Zellen mit einer vorgewärmten, desinfizierten Schaufel schnell von der Filterscheibe abkratzen.
Legen Sie sofort die gesamte Schaufel mit den geernteten Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist. Das geerntete Pellet sollte vollständig mit flüssigem Stickstoff bedeckt sein. Lassen Sie das Pellet gründlich einfrieren und entdrängen Sie gefrorene Zellen mit einer zuvor abgekühlten Schaufel.
Schließen Sie den Deckel und stellen Sie sicher, dass er durchstochen ist. Dies ist wichtig, da flüssiger Stickstoff aufgrund der Druckänderung bei der Verdampfung dazu führen kann, dass geschlossene Behälter explodieren. Bereiten Sie GMPP, DNA-Abstrich und frische Eppendorf-Röhrchen für Lysase vor.
Bereiten Sie den Lysepuffer bei Bedarf unter Zugabe von Chloramphenicol vor. 500 Mikroliter Lysepuffer pro Probe in separate Eppendorf-Röhrchen zuordnen und auf Eis legen. Dekontaminieren Sie Mörser und Stößel mit einem Labordesinfektionsmittel und 70% Ethanol.
Kühlen Sie Mörser und Stößel, indem Sie flüssigen Stickstoff in den Mörser gießen. Das gefrorene Bakterienpellet in einen vorgekühlten Mörser überführen und zu einem Pulver mahlen. Fügen Sie ungefähr ein Volumen Aluminiumoxid hinzu und schleifen Sie weiter.
Halten Sie Mörser, Stößel und die Zellen kühl, indem Sie bei Bedarf flüssigen Stickstoff gießen, um den Inhalt des Mörtels nicht auftauen zu lassen. Kurz vor der Verwendung GMPPNP und DNA-Abstrich in das Lysepuffer-Aliquot geben. Die Lösung in den Mörtel überführen und weiter mahlen.
Lassen Sie die Lysase beim Schleifen langsam auftauen. Wenn die Lysase vollständig auftaut, die Mischung in das vorgekühlte Eppendorf-Rohr geben und zum Eis zurückkehren. Zentrifugenlysase bei 20.0000 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Überstände in frische, vorgekühlte Eppendorf-Röhren geben und auf Eis legen. Messen Sie die RNA-Konzentration in jeder verdünnten Probe mit NanoDrop. Teilen Sie jedes Lysat in zwei Portionen, 0,5 bis 1 Milligramm RNA für RIBO-seq und den Rest für RNA-seq.
Zu einem Milligramm der RNA fügen Sie 3,8 Mikroliter MNase in Tris pH 8 hinzu und ergänzen Sie es mit Lysepuffer auf das Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern. Bei 25 Grad Celsius, 300 Schuss pro Minute, für 45 Minuten inkubieren. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, reinigen Sie die Proben mit einem handelsüblichen RNA-Reinigungskit.
Bereiten Sie 15% Polyacrylamid-FSME-Gel mit acht molaren Harnstoff vor und legen Sie es in einen Tank mit FSME-Puffer. Mindestens 10 Minuten bei einer konstanten Spannung von 200 Volt vorlaufen. Mischen Sie die Proben mit dem TSME-Harnstoff-Probenpuffer.
Denaturieren Sie bei 95 Grad Celsius für eine Minute und legen Sie sie sofort auf Eis. Waschen Sie den Harnstoff aus, indem Sie TSME-Puffer mit einer Spritze in Gelbrunnen injizieren. Laden Sie die Proben und lassen Sie einen Vertiefungsraum zwischen ihnen, um jede Probe zu trennen und Kreuzkontaminationen zu verhindern.
Verwenden Sie 29 Nukleotide-lange Oligos und eine Mischung aus 26 und 32 Nukleotiden-langen Oligos als Marker. Führen Sie die Elektrophorese mit einer konstanten Spannung von 180 Volt durch. Bereiten Sie einen sterilen Puffer für die Inkubation über Nacht vor.
Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, färben Sie das Gel mit SYBR Gold. Fragmente des Gels zwischen 26 und 32 Nukleotiden mit einer sterilen Nadel oder einer Rasierklinge herausschneiden und die Gelfragmente in separate Eppendorf-Röhrchen geben. Wechseln Sie die Nadel oder Rasierklinge zwischen den Proben.
Fügen Sie jedem Eppendorf 200 Mikroliter Übernachtinkubationspuffer hinzu und inkubieren Sie die Proben bei 10 Grad Celsius, 1000 Schuss pro Minute, über Nacht. Reinigen Sie die Proben am nächsten Tag mit einem RNA-Reinigungskit und eluieren Sie sie in 18 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Die erhaltenen ribosomalen Fußabdrücke sind bereit für die Bibliotheksvorbereitung.
Führen Sie eine ribosomale RNA-Depletion für Proben für RNA-seq mit einem kommerziell erhältlichen Kit durch. Als nächstes reinigen Sie die Proben mit einem RNA-Reinigungskit. Führen Sie die alkalische Hydrolyse wie folgt durch; bereiten Sie den alkalischen Hydrolysepuffer vor, fügen Sie ein Volumen des Puffers zu einem Volumen der Probe hinzu und inkubieren Sie bei 95 Grad Celsius für 25 Minuten.
Fügen Sie fünf Mikroliter von 3 molaren Natriumacetat pH 5,5 zu jeder Probe hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Reinigen Sie die Proben mit einem RNA-Reinigungskit und eluieren Sie sie in 18 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Die erhaltene zufällig fragmentierte RNA ist bereit für die Bibliotheksvorbereitung.
Fügen Sie jeder Probe 10 Mikroliter 10x Reaktionspuffer und fünf Mikroliter T4-Polynukleotidkinase hinzu. Eineinhalb Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach dieser Zeit drei Mikroliter mit einem millimolaren ATP hinzufügen und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Als nächstes reinigen Sie die Proben mit einem RNA-Reinigungskit. Führen Sie die Bibliotheksvorbereitung mit dem handelsüblichen Kit gemäß dem hier bereitgestellten Protokoll durch. Führen Sie PAGE mit 6% Polyacrylamid-Gel durch.
Das Gel mit SYBR Gold beflecken. Verbrauchen Sie Gelfragmente, die die Bibliotheken enthalten. Für RNA-seq-Proben liegt die Bibliothek zwischen 135 und 180 Nukleotiden, für RIBO-seq zwischen 135 und 170 Nukleotiden.
Verwenden Sie sterile Nadeln oder Rasierklingen und legen Sie die herausgeschnittenen Gelfragmente in separate Eppendorf-Röhrchen. Denken Sie daran, die Nadel oder Rasierklinge zwischen den Proben zu wechseln. Fügen Sie jedem herausgeschnittenen Gelfragment 100 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu.
Und inkubieren Sie sie bei 10 Grad Celsius, 450 Schuss pro Minute, über Nacht. Reinigen Sie die Proben am nächsten Tag mit einem DNA-Reinigungsset. Die erhaltenen Bibliotheken sind bereit für die Qualitäts- und Quantitätskontrolle mit hoher Empfindlichkeit, DNA-On-Chip-Elektrophorese und dann für die Sequenzierung der nächsten Generation.
Die resultierenden cDNA-Bibliotheken stellen eine angemessene Quantität und Qualität dar, die für die Sequenzierung der nächsten Generation erforderlich ist, wie durch hochempfindliche DNA-On-Chip-Elektrophorese bestätigt wird. Die Bänder und Peaks, die die RIBO-seq-Bibliotheken repräsentieren, sind enger und besser definiert, verglichen mit denen, die die RNA-seq-Bibliotheken darstellen. Nach der On-Chip-Elektrophorese haben die Bibliotheken die erwartete Linse.
Die zusätzlichen Peaks, die näher an 200 Basenpaaren in RIBO-seq-Bibliotheken vorhanden sind, können auf überwinternde Ribosomen, nicht vollständig verdaute ribosomale Fußabdrücke oder Artefakte, z. B. rRNA, hinweisen und können während der bioinformatischen Analyse verworfen werden, wenn die aus der Sequenzierung gewonnenen Daten getrimmt und rRNA tRNA gefiltert wird. Die durchschnittliche Menge an cDNA, die bei der Bibliotheksvorbereitung erzeugt wird, beträgt 32 Nanogramm, was eine ausreichende Menge an Material liefert, die für die Sequenzierung der nächsten Generation benötigt wird. Nach der Qualitätskontrolle durch On-Chip-Elektrophorese wurden Bibliotheken für die Einzel- und 50-Basenpaar-Sequenzierung auf der NextSeq 500-Plattform von Illumina gezogen.
Das Trimmen der Adapter und Sequenzen von schlechter Qualität führte zu 25 bis 47 Millionen Lesevorgängen pro Probe für RNA-seq-Proben und 25 bis 50 Millionen Lesevorgängen pro Probe für RIBO-seq-Proben. Die gewonnenen Daten wurden mit FastQC qualitätskontrolliert. Sowohl RNA-seq- als auch RIBO-seq-Proben wiesen eine sehr gute Qualität auf.
Die Kartierung der nach dem beschriebenen Protokoll erstellten Bibliotheken ergab 2,4 bis 9,6 Millionen eindeutig zugeordnete Lesevorgänge pro Probe für RNA-seq-Proben und 2,3 bis 10,4 Millionen eindeutig zugeordnete Lesevorgänge für RIBO-seq-Proben. RIBO-seq-Daten weisen eine dreifache Periodizität und einen hohen, schmalen Peak auf, der den initiierenden Ribosomen entspricht und für die ribosomalen Fußabdrücke charakteristisch ist, was in den RNA-seq-Daten nicht beobachtet wird. Darüber hinaus zeigt das Diagramm, das die Profile der durchschnittlichen Abdeckung von ribosomalen Fußabdrücken und mRNA-Fragmenten auf den kodierenden Sequenzen zeigt, den höheren Anteil der Lesevorgänge, die den CDS im RIBO-seq-Datensatz zugeordnet sind, wie erwartet.
Die Visualisierung der kartierten ribosomalen Fußabdrücke zeigte sehr ähnliche Muster im Vergleich zu den Ergebnissen desselben Experiments, das entsprechend dem Standard-RIBO-seq-Verfahren durchgeführt wurde, das die Monosomenrückgewinnung durch Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation umfasst. Unser Protokoll wurde verwendet, um die Translationsregulation unter verschiedenen Wachstumsbedingungen zu untersuchen, kann aber angewendet werden, um andere Aspekte der Translation zu untersuchen, wie den Nachweis von Translationsinitiierungsstellen und neuartige proteinkodierende Gene. Die Sequenzierung der nach unseren Richtlinien erstellten Bibliotheken liefert ausreichende Daten für eine umfassende bioinformatische Analyse.
Das Protokoll, das wir hier vorstellen, ist schnell, einfach und kostengünstig und kann mit Standardlaborgeräten durchgeführt werden.
