Этот протокол важен, потому что он предназначен для ответа на вопросы о структурной функции коррелята мышиного легочного клапана, что, как правило, сложно из-за присущей ему гетерогенности. Контролируемая фиксация и коррелятивная визуализация использовались для захвата структуры на нескольких масштабах длины. Локальные изображения с высоким разрешением затем могут быть сопоставлены с точным анатомическим местоположением на легочном клапане.
Продемонстрировать процедуру будет доктор Тай И, директор по микрохирургии в Центре регенеративной медицины При Национальной детской больнице. Начните с автоклавирования инструментов, необходимых для рассечения мыши, включая тонкие ножницы, микрофорсы, микрососудистые зажимы, щипцы для применения зажимов, держатели микроигл, пружинные ножницы и втягивающие средства. После усыпления взрослой мыши C57BL/6 поместите ее в дорсальное лежачее положение на лотке, закрепите ее конечности скотчем и выполните торакотомию.
Обнажите сердце, удалив излишки жировой ткани и фасции, затем удалите правое предсердие и перфузите левый желудочек физиологическим раствором комнатной температуры. Удалите все сердце, разрезав верхнюю полую вену, нижнюю полую вену, легочную артерию и аорту, и разрезайте примерно на два миллиметра выше желудочкового соединения, которое будет служить каналом для наддува. Удалите левый и правый желудочки, чтобы подвергнуть камеры атмосферному давлению, гарантируя, что структура легочного ствола не будет затронута удалением желудочков.
Анастомозная трубка напора с легочной артерией, оставляя приблизительно одно миллиметровое расстояние между синотубулярным соединением и концом трубки для размещения больших движений листочков и легочного ствола. Поднимите резервуар до аналогичного физиологического давления и заполните его солевым раствором. Проверьте проточную систему, чтобы убедиться в отсутствии засоров или пузырьков воздуха.
Прикрепите запорный кран к анастомозированному легочному клапану и обеспечьте достаточный поток через трубку, переключив тракт оттока. Как только поток будет достаточным, переключите отток на анастомозированный легочный клапан и обеспечьте давление легочной ствола, определяемое растяжением ствола. После подтверждения герметизации легочной ствола постепенно включайте первичный фиксаторный раствор до тех пор, пока не будет продувано 25% емкости резервуара солевого раствора.
Поместите пропитанную фиксаторами марлю на образец ткани, чтобы предотвратить высыхание. Перфьмируйте фиксатор в течение трех часов, заправляя резервуар для поддержания постоянного давления. После перфузии храните сердечный клапан в фиксаторном растворе при четырех градусах Цельсия до использования в течение одной недели.
Для окрашивания промыть образец неподвижного сердечного клапана три раза холодным 0,15 молярным какодилатным буфером в течение пяти минут и полностью погрузить сердечный клапан в раствор из 1,5 ферроцианида калия, 0,15 молярного какодилата, двух миллимоляров хлорида кальция и 2%-ного тетроксида осмия на льду в течение одного часа. Промыть образцы двойной дистиллированной водой комнатной температуры, поместив их в трубку на пять минут с легким перемешиванием. После еще трех промывок поместите образец в фильтрованный раствор тиокарбогидразида при комнатной температуре.
Через 20 минут промыть образец три раза водой, как показано ранее. Затем поместите образец в 2% тетроксид осмия при комнатной температуре. Через 30 минут промыть его водой три раза в течение пяти минут каждый и инкубировать образец в 1% уранилацетата в течение ночи при четырех градусах Цельсия.
Тем временем готовят раствор нитрата свинца. На следующий день выполните этап промывания три раза, как было показано ранее, затем инкубируют ткань сердечного клапана в растворе аспартата свинца при 60 градусах Цельсия в течение 30 минут. Промыть образцы еще три раза, затем выполнить серийную обработку обезвоживания тканей сердечного клапана свежеприготовленным 20, 50, 70 и 90% этанолом на льду в течение пяти минут каждая, после чего следуют две последующие обработки 100% этанолом.
После обезвоживания переместите ткани в ледяной холод ацетона, затем поместите его в свежий ацетон комнатной температуры на 10 минут. Для встраивания внесите смоляную смесь в соответствии со спецификациями производителя. Поместите ткани в последующие обработки от 25 до 75, от 50 до 50 и от 75 до 25 смол в смесь ацетона в течение двух часов каждая.
Наконец, поместите ткани в 100% смолу на ночь. На следующий день поместите ткани в свежую 100% смолу. Через два часа перенесите ткани во встраиваемую капсулу, добавьте свежую 100% смолу и поместите ее в духовку с 60 градусами Цельсия на 48 часов для лечения.
Здесь показана иссеченная анастомозированная легочная артерия до и после применения гидростатического давления. Легочный ствол растяжение радиально указывает на то, что листочки легочного клапана находятся в закрытой конфигурации. Микрокомпьютная томография подтвердила подтверждение легочного клапана.
Листочки были закрыты, а кольцевое кольцо было круглым, в то время как наблюдалась различная степень неадекватного давления легочного клапана либо фиксацией, либо артериальным коллапсом. Виртуальные поперечные сечения объемного рендеринга микроКТ коррелировали с оптическими изображениями для подтверждения направления и местоположения нарезки. Изображения SEM высокого разрешения SBF были сделаны в локальном регионе внутри листовки, когда блок образцов находился в нужном месте и ориентации.
Здесь показаны коррелированные изображения между виртуальным срезом рендеринга объема микро КТ, изображениями SEM с низким разрешением и SBF SEM высокого разрешения. В 3D-представлении сегментированной области легочного клапана могут быть идентифицированы внеклеточные компоненты, такие как эндотелиальные клетки, клапанные интерстициальные клетки и внеклеточные волокна. При попытке использовать этот протокол, пожалуйста, имейте в виду, что выполнение надавливания имеет решающее значение и гарантирует, что выход будет как можно выше.
