Конструкция липидных двухслойных мембран, описанная в этом протоколе, может быть использована для получения важной информации о мембранных взаимодействиях с фармацевтическими агентами, токсикантами окружающей среды и даже биологическими соединениями. Эти методы могут быть использованы для изготовления мембран различной сложности жидкости, а также для оценки проницаемости соединений, абсорбции и встраивания в мембраны. Для начала добавьте соответствующий объем раствора липидного сырья в чистую стеклянную мерзость, чтобы достичь конечной концентрации пузырьков 2,5 миллиграмма на миллилитр после регидратации.
Удалить хлороформ из раствора липидов, используя струю газообразного азота. Чтобы обеспечить полное удаление хлороформа, подключите высушенную липидную пленку к вакууму не менее четырех часов. Регидратируйте высушенную липидную пленку требуемым объемом буфера хлорида натрия Tris, чтобы получить конечную концентрацию пузырьков 2,5 миллиграмма на миллилитр, и вихрь в течение приблизительно 15-30 секунд.
Переложите везикулярную суспензию в контейнер с сухим льдом до замораживания в течение примерно 30 минут. После того, как образец будет полностью заморожен, разморозьте суспензию на водяной бане с температурой от 30 до 40 градусов цельсия. Вихревая размороженная везикулярная суспензия.
Чтобы сделать один миллилитр или меньше везикул, приобретите мини-экструдер. Предварительно смочите опору фильтра сверхчистой водой, затем поместите ее на опорную поверхность мембраны внутри кольца O. Повторите для второй внутренней мембранной опоры.
Поместите одну внутреннюю мембранную опору во внешний корпус экструдера. Поместите одну 100-нанометровую поликарбонатную мембрану на внутреннюю мембранную опору непосредственно над опорой фильтра. Поместите вторую внутреннюю мембранную опору во внешний корпус экструдера с кольцом O и опорой фильтра, обращенной к поликарбонатной мембране.
Прикрепите подшипник политетрафторэтилена к стопорному узлу и завинтите его закрытым наружным корпусом экструдера. Закрепите экструдер в нагревательном блоке. Загрузите суспензию липидного пузырька в один из шприцев и поместите шприц в тепловой блок экструдера, полностью вставив иглу в один конец экструдера.
Вставьте второй пустой шприц в противоположную сторону и зафиксируйте оба шприца с помощью зажимов на тепловом блоке. Медленно вдавите вяленую суспензию в пустой шприц, а затем обратно в исходный шприц. Повторите еще 20 раз, в общей сложности 21 проход через поликарбонатную мембрану.
Переложите липидные везикулы в чистую стеклянную мерзость для хранения. Чтобы выдавить от пяти до 50 миллилитров везикул, соберите большой экструдер, поместив большую отверстие экранной опоры, центрированный диск, дренажные диски и поликарбонатную мембрану в пространство в нижней опоре экструдера. Соедините верхнюю и нижнюю опоры экструдера с помощью четырех винтов и затяните.
Прикрепите блок экструдера к цилиндру для образцов, почистив его до дна и затянув гаечным ключом для фиксации. Наполните цилиндр для проб сверхчистой водой и выдавите воду через экструдер перед добавлением образца в цилиндр для образцов. Добавьте суспензию липидного пузырька в цилиндр для образцов и прикрутите верхнюю закрытую часть.
Медленно увеличивайте давление до тех пор, пока образец не начнет капать из экструдера со скоростью примерно две-три капли в секунду в чистую стеклянную мерзость. После того, как весь образец будет экструдирован, выключите подачу азота и спустите давление в цилиндре для образцов, медленно открыв клапан сброса давления. Перелейте липидные везикулы обратно в цилиндр образца и повторите предыдущий шаг еще девять раз, в общей сложности 10 экструзий.
Загрузите везикулярную суспензию в соответствующую кювету и вставьте в прибор динамического рассеяния света, введите детали образца и выполните измерение с помощью соответствующего программного обеспечения. Поместите дзета-ячейку в камеру для отбора проб, убедившись, что электроды находятся в контакте, и закройте крышку держателя образца. В соответствующем программном обеспечении введите сведения о образце и соберите измерения.
Вставьте датчик кварцевого кристалла с кодировкой кремнезема в модуль потока, убедившись, что Т-образная форма на кристалле совпадает с Т-образной формой на модуле, и завинтите модуль потока закрытым. В инструментах с несколькими камерами параллельно могут образовываться дополнительные бислои. Подключите впускную и выпускную трубки к проточному модулю и насосу.
Поместите трубку в удерживающую кожухи и закройте крышку анализаторной системы. Поместите контейнер для отходов на выходе из насоса для сбора отработанных растворов. Для выполнения очистки сначала включите насос и установите скорость потока на 400 микролитров в минуту.
Вставьте впускную трубку в сверхчистую воду и пропустите через модуль от пяти до 10 миллилитров. Переключите трубку в SDS и пропустите от пяти до 10 миллилитров через модуль. Переключите трубку обратно в сверхчистую воду и протейте через модуль от 10 до 20 миллилитров.
Наконец, пропустите воздух через модуль до тех пор, пока не будет собран оставшийся раствор. Извлеките датчик из модуля потока и промойте его сверхчистой водой. Управляйте датчиком и модулем потока с потоком газообразного азота, следя за тем, чтобы электрод всегда оставался свободным от любой жидкости.
В химический вытяжной капюшон вставьте кварцевый кристаллический датчик с кремнеземным покрытием в ультрафиолетовый или озоноочистительный прибор. Включите инструмент и оставьте обработку не менее двух минут. Осторожно извлеките датчики и верните их в модуль потока.
Включите анализатор, чтобы подключить соответствующее программное обеспечение и установить температуру на желаемое значение для формирования поддерживающего липидного бислоя. Позвольте температуре стабилизироваться до нужного входа. Настройте измерение и найдите все резонансные частоты датчика, а также рассеивание для обертонов три, пять, семь, девять, 11 и 13 перед началом измерения.
Позвольте Tris хлориду натрия протекать через модуль в течение пяти-10 минут, гарантируя, что базовое изменение частоты или delta F и изменение диссипации или значения Delta D в жидкости остаются стабильными. Остановите насос, извлеките впускную трубку из раствора натрия Tris и осторожно вставьте ее в раствор липидных пузырьков. Обратный поток в течение пяти секунд, чтобы удалить любые пузырьки воздуха из впускной трубки, а затем продолжить прямой поток.
Перезапустите измерение в программном обеспечении, чтобы свести к нулю базовый уровень. Поток липидных везикул до образования бислоя наблюдается в режиме реального времени в программном обеспечении для сбора данных. Затем повторите этот шаг, чтобы изменить впускную трубку с липидных пузырьков обратно на буфер хлорида натрия Tris.
Добавьте пять микролитров липидного раствора в донорский отсек, который представляет собой пористый поливинилидендифторид 96 скважины с многоэкранной фильтрующей пластиной с размером пор 0,45 микрометра. Немедленно погрузите фильтрующую пластину в отсек акцептора, который представляет собой транспортную приемную пластину, содержащую 300 микролитров фосфатно-буферного физиологического раствора. Добавьте 200 микролитров фосфатно-буферного физиологического раствора в отсек транспортного донора.
Выполните предыдущие шаги по остановке насоса и замене входной трубки на раствор липидных пузырьков и наблюдению за образованием бислоя, затем замените впускную трубку на альфа-спиральный или ГЛТИДный раствор AH. Вводите раствор в модуль потока до тех пор, пока не будет наблюдаться изменение частоты и диссипации от добавления нового раствора. Остановите насос и дайте пептиду АГ инкубироваться с везикулами в течение 10 минут.
Переключите впускную трубку в Tris хлорид натрия и запустите поток, чтобы удалить пептид AH из разорванных везикул, что приведет к успешному образованию липидного бислоя. Сначала протолкните молекулу растворителя, затем переключите входную трубку в раствор, содержащий интересующую молекулу, и течь в течение, по меньшей мере, пяти минут. При желании остановите поток и дайте жидкости, содержащей нужную молекулу, инкубироваться с бислоем.
Замените впускную трубку обратно на молекулярный растворитель. Течь в течение не менее пяти минут, затем переключите впускную трубку на Tris натрия хлорид и течь в течение не менее пяти минут. В программном обеспечении остановите измерение, сохраните файл и остановите насос.
Сразу после выполнения предыдущих шагов для однолипидного взвешенного бислоя или для многолипидного взвешенного бислоя удалите PBS из отсека донорной фильтрующей пластины и замените 200 микролитрами тестового раствора. Немедленно погружайтесь в новую транспортную приемную пластину с 300 микролитрами PBS. После инкубации с мягким раскачиванием в течение двух часов при 25 градусах Цельсия соберите 150 микролитров раствора из донорского и акцепторного отсеков.
Измерьте концентрацию молекулы в обоих образцах с помощью соответствующего метода, основанного на свойствах этой молекулы. Сравнивались размер, полидисперсность и дзета-потенциал однолипидных яйцеклеток PC везикул и двух составов многолипидных пузырьков. Распределение по размерам везикул PC яйца и многолипидных везикул было почти идентичным.
Как яйцеклетка, так и PC мультилипидные везикулы были отрицательно заряжены, в то время как мультилипидные две везикулы были положительно заряжены. Однолипидные яйцеклетки PC везикулы легко всасываются на поверхность, о чем свидетельствует уменьшение изменения частоты и увеличение изменения диссипации с последующим самопроизвольным разрывом. Многолипидные везикулы всасываются на поверхность, но требуют добавления пептида АГ для разрыва везикул, в результате чего образуются липидные бислои.
С поддерживаемыми липидными бислоями изменение частоты и изменение диссипации могут быть проанализированы до и после введения интересующего соединения. Например, исследованы взаимодействия DEHP и экологического токсиканта с поддерживаемым уни и многослойными слоями. Аналогичные уровни абсорбции DEHP наблюдались для обоих типов липидных бислоев.
Тем не менее, различия в изменении диссипации наблюдались между бислоями с большим изменением диссипации, наблюдаемым для бислоя яйца PC по сравнению с многолипидным однослойным. Малое проникновение наблюдалось как для одно-, так и для многолипидных бислоев. После этой процедуры могут быть разработаны различные клеточные имитирующие липидные бислои, чтобы обеспечить бесклеточный скрининг молекулярных взаимодействий с соединениями, начиная от фармацевтических препаратов и заканчивая токсикантами окружающей среды.
