Этот протокол важен тем, что он обеспечивает полную процедуру создания капель из липидной пленки в липидный раствор для микропузырьков, а затем для капель. Основным преимуществом данной методики является простота конденсации микропузырьков в капли. Просто путем охлаждения и закрутки капельки могут быть изготовлены без необходимости герметизации.
Визуальная демонстрация имеет решающее значение, потому что простой тест, чтобы увидеть, были ли микропузырьки успешно конденсированы, заключается в визуальной проверке изменения полупрозрачность. Продемонстрировать процедуру будет Кимун Ю, студент магистратуры в лаборатории Ган Чжэн. Используя декапер, снимите алюминиевое уплотнение на флаконе сыворотки и перенесите один миллилитр липидного раствора в флакон с образцом боросиликатного стекла емкостью 1,85 миллилитра с фенольной винтовой крышкой, позволив раствору липидов стекать по внутренней стенке без создания пузырьков.
С помощью флакона с образцом 1,85 миллилитра приготовьте к поступлению газа декафторбутана в пространство пробирки образца с помощью газообменника. Убедитесь, что все клапаны газообменника правильно закрыты, а насос выключен. Откройте клапан коллектора и аккуратно отстегнивайте соответствующую иглу от коллектора.
Откройте клапан давления A и клапан давления B и поверните клапан газового баллона примерно на 1/16 до 1/8 против часовой стрелки, чтобы частично открыть его. Откройте клапан ручки Т и свяжете флакон с образца раствором липидов. Поместите иглу коллектора над интерфейсом жидкого воздуха флакона, медленно поверните клапан регулятора воздуха по часовой стрелке, пока стрелка датчика регулятора воздуха не слегка не сдвинется из своего положения покоя, и позвольте перфторуглеродному газу мягко течь в пространство над головой флакона в течение 30 секунд, заботясь о том, чтобы не создавать пузырьков.
При необходимости отрегулируйте клапан регулятора воздуха. Через 30 секунд осторожно и быстро храните флакон с образцом, не слишком двигая флакон. Клапан газового баллона, клапан Т-ручки, клапан регулятора воздуха, клапан давления A, клапан давления B и клапан коллектора.
Тщательно обшивайте иглу, затем маркируете флакон с образцом и запечатываете горловину восковой пленкой по часовой стрелке. Храните флакон с образцом в темноте и при четырех градусах Цельсия в течение не менее 10 минут или до 24 часов. Поместите около 100 граммов сухого льда в изолированный контейнер на место обычного льда в другой изолированный контейнер.
Извлеките предварительно приготовленный флакон с декафторбутановой сывороткой до 1,5-дюймовых игл 20-го калибра, пластиковый шприц на один миллилитр, контейнер емкостью 200 миллилитров, металлические щипцы и термометр. Поместите флакон с липидным раствором в механическую мешалку и перемешивайте в течение 45 секунд. Должно происходить изменение цвета и полупрозрачность.
После механического перемешивания встаньте флакон с образцом правой стороной вверх, защищенный от света, и начните 15-минутный обратный отсчет, чтобы остыть флакон и выбрать размер микропузырьков. Когда обратный отсчет достигнет 10 минут, заполните контейнер примерно 200 миллилитрами изопропанола и охладите его до минус 20 градусов Цельсия сухим льдом с помощью металлических щипцов. После того, как микропузырьки были отобраны в течение 15 минут, найдите выбранный размер раздела внутри флакона с образцом.
Держа флакон с образцом правой стороной вверх, осторожно расстегнуть флакон с образца и изолировать около 0,7 миллилитров нижней перегородки с помощью 1,5-дюймовой иглы 20-го калибра, прикрепленной к пластиковому шприцеву на один миллилитр. Убедитесь, что ни одна из верхних перегородок не снята, и не щелкайте шприцем, чтобы удалить воздушные карманы. Нацеливаясь на центральный круг на резиновой пробке, вставьте другую иглу 20 калибра в флакон с сывороткой декафторбутана, удерживая иглу в верхней части флакона сыворотки для вентиляции, а затем вставьте иглу с выбранным размером микропузырьков.
Медленно переносите размер выбранных микропузырьков. Дайте жидкости осторожно скользить по внутренней стенке флакона с сывороткой декафторбутана. После того, как весь выбранный размер микросубблока будет перенесен, удалите иглу со шприца, но держите вентиляционную иглу, чтобы снять отрицательное давление.
Добавьте небольшое количество сухого льда или изопропанола комнатной температуры в изопропаноловую ванну, чтобы температура ванны была от минус 15 до минус 17 градусов по Цельсию. С помощью вентиляционной иглы 20 калибра, вставленной в верхнюю часть флакона сыворотки, поместите флакон сыворотки и изопропаноловую ванну, сохраняя уровень микропузырька ниже уровня изопропанола, но шейку флакона над ним и периодически закручивайте флакон сыворотки в течение двух минут, чтобы конденсировать микропузырьки. Не закручивайте флакон сыворотки непрерывно в изопропаноле и не дайте раствору замерзнуть.
Закрутите около пяти секунд и вынимите флакон сыворотки из изопропанола. Проверьте зарождение льда, затем возобновите закручивание изопропанола. Если есть образование льда, закрутите флакон сыворотки в воздухе, пока он не рассеется.
После двухминутной конденсации извлеките флакон сыворотки из изопропанольной ванны и удалите вентиляционную иглу. Микропузырьки должны были конденсироваться в капли, о чем свидетельствует изменение полупрозрачность. Протрите флакон сыворотки, наклейте на него этикетку и поместите на обычный лед в темный изолированный контейнер до готовности к использованию.
Неоткрытые капли с неповрежденным алюминиевым уплотнением должны быть стабильными до шести часов, пока расплавленный лед заменяется по мере необходимости. Когда он будет готов к использованию, снимите алюминиевое уплотнение с помощью декаппера. После использования этого протокола предварительно конденсированные микропузырьки выбранного размера и постконденсированные капли были рассчитаны на счетчике Coulter с диафрагмой 10 микрон.
Показаны данные о размерах для 30% пиролипидного состава. Статистика, основанная на данных о размерах, показана здесь. Используя соотношение средних диаметров до и после конденсации, результаты показали, что по мере увеличения содержания пиролипидов концентрация уменьшалась, а средний диаметр увеличивался.
Показаны измерения репрезентативных абсорбентов образца 30% пиролипидных капель. Это показало, что неповрежденные сборки имеют различные оптические свойства, отраженные различным пиком по сравнению с отдельными несобранными липидными компонентами. Здесь показаны репрезентативные измерения цветения предварительно конденсированного микросубблированного, постконденсированного образца капель с 30% пиролипидами, демонстрирующие различные пики флуоресценции для интактных образцов в нарушенной форме.
Показаны репрезентативные ультразвуковые изображения образца 30% пиролипидных капель, изображенного при различных давлениях. При низких давлениях наблюдался только фоновый сигнал от пузырьков воздуха, застрявших от синтеза агара. При несколько большей мощности было сгенерировано несколько микропузырьков, о чем свидетельствует появление ярких пятнышек.
По мере увеличения давления генерировалось больше микропузырьков. Важно помнить, что температура конденсации здесь оптимизирована для этой конкретной композиции капельной оболочки. Различные составы скорлупы могут требовать разной температуры.
