Этот протокол описывает систему химической димеризации для индуцирования белковых конденсатов на теломерах. Он может быть легко адаптирован для индуцирования конденсатов на других геномных локусах и подходит для прощуптывания образования и функции конденсатов, связанных с хроматином. Этот метод обеспечивает временное разрешение, необходимое для визуализации живых клеток, и поддерживает разделение фаз в популяции клеток для биохимических анализов.
Для начала растворите димеризаторы в ДМСО на 10 миллимоляров и храните их в пластиковых микроцентрифужных трубках при минус 80 градусах Цельсия для длительного хранения. Разбавить аликвоту 10-миллимолярного димеризатора в среде визуализации до концентрации запаса 10 микромолярной и хранить ее при минус 20 градусах Цельсия. Когда они будут готовы к использованию, разбавьте димеризаторы до конечной рабочей концентрации 100 наномоляров в питательной среде или среде визуализации.
Посеять с 10 до пятой ячейки в круглых покровных стеклах диаметром 12 миллиметров, покрытых поли-D-лизином, в шестиямямямяцной пластине. Затем трансфектируют клетки с помощью мутантных плазмид Halo-GFP-TRF1 и mCherry-eDHFR-SIM или mCherry-eDFR-SIM и подождите от 24 до 48 часов, прежде чем приступить к иммунофлуоресценции. Добавьте к клеткам разбавленные 100 наномолярных димеризаторов и инкубируем их при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех-пяти часов.
После инкубации зафиксируйте клетки в растворе PBS, содержащем 4%формальдегид и 0,1% тритона X-100, в течение 10 минут при комнатной температуре для пронизывания клеток. Затем трижды промыть клетки PBS. Крышка для стирки проскальзывает дважды с 50 микролитрами TBS-Tx и один раз с 50 микролитрами буфера разбавления антител.
Инкубируйте каждый противоскользящий слип с 50 микролитрами первичного анти-PML, анти-SUMO-1 или анти-SUMO-2 и 3 антитела при четырех градусах Цельсия в увлажненной камере на ночь. Крышка для стирки трижды скользит с буфером разбавления антител для удаления несвязанным первичным антителом, затем инкубирует клетки с вторичным антителом в течение одного часа в темном ящике при комнатной температуре. После окрашивания крышка для стирки трижды скользит с TBS-Tx.
Метьте слайды, добавляя два микролитра по одному микрограмму на миллилитр DAPI, затем переворачивайте крышку и помещайте их на каплю DAPI. Аспирировать лишнюю жидкость с края крышки. Запечатайте горку лаком для ногтей, дайте ей высохнуть и промойте верхнюю часть крышки водой.
Поместите слайды в морозильную камеру до тех пор, пока не будет подана изображение. Посейте 10 до пятой клетки на 12-миллиметровой круглой крышке очков, покрытых поли-D-лизином, в шестиямяцной пластине и трансфектируем их с Halo-TRF1 и mCherry-eDHFR-SIM или mCherry-eDHFR-SIM мутантными плазмидами. Зафиксируйте клетки 4%-формальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре и промыть их четыре раза PBS.
Для IF-FISH окрасьте клетки первичными и вторичными антителами и повторно зафиксируют их 4%-формальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре, затем промыть их четыре раза PBS и обезвоживать крышку в серии этанола. Инкубируют крышку с помощью 488 теломер C-PNA зонда в пяти микролитрах гибридизационного раствора при 75 градусах Цельсия в течение пяти минут, затем инкубируют крышку на ночь в увлажненной камере при комнатной температуре. Промывайте крышку три раза с помощью буфера для стирки в течение двух минут на стирку при комнатной температуре и монтируем их с помощью одного микрограмма на миллилитр DAPI в монтажных носителях для визуализации.
Для визуализации в реальном времени установите крышку в магнитных камерах на нагретой ступени в камере окружающей среды, поддерживая клетки в одном миллилитрах среды визуализации без фенол-красного цвета. Настройте микроскоп и аппарат контроля окружающей среды, как описано в тексте рукописи. Найдите клетки с ярким сигналом GFP на теломерах и диффузным сигналом mCherry в цитозоле.
Найдите около 20 клеток, запоминая каждую позицию с помощью информации XYZ, и настройте параметры для покадровой визуализации. Используйте расстояние в 0,5 микрометра для восьми микрометров в Z и пятиминутный интервал времени в течение двух-четырех часов для каналов GFP и mCherry. Используйте 30% от 594 нанометров и 50% от 488 нанометровой интенсивности мощности, со временем экспозиции 200 миллисекунд и усилением камеры 300.
Запустите визуализацию и пройдите один временной цикл в качестве предварительной димеризации. Затем приостановите визуализацию, добавьте 0,5 миллилитра носителя изображения, содержащего 15 микролитров 10 микромоляльных димеризаторов, в камеру визуализации, заботясь о том, чтобы не коснуться сцены, и возобновите визуализацию. Когда все будет готово к обратной димеризации, приостановите визуализацию и добавьте в камеру визуализации 0,5 миллилитра среды визуализации, содержащей два микролитра 100 миллимолярного запаса TMP.
Продолжайте визуалить клетки в течение одного-двух часов. Для фиксированной визуализации используйте ту же настройку микроскопа, что и живая визуализация, но без нагрева сцены. Найдите от 30 до 50 клеток с красным сигналом, чтобы выбрать для трансфектированных клеток.
Получайте изображения с интервалом 0,3 микрометра в общей сложности восемь микрометров в Z.Используйте 80% 647 нанометров, 80% 561 нанометра и 70% 488 нанометровой интенсивности мощности, со временем экспозиции 600 миллисекунд и коэффициентом усиления камеры 300. Теломерная локализация SUMO была идентифицирована с использованием иммунофлуоресценции теломерной ДНК FISH и белка SUMO. Клетки с рекрутированием SIM-карты обогащаютСЯ SUMO-1 и SUMO-2 и 3 по сравнению с клетками с набором мутантов SIM, что указывает на то, что димеризация SIM-индуцировала обогащение SUMO на теломерах, зависит от взаимодействий SUMO-SIM.
Здесь показан покадровый фильм TRF-1 и SIM-карты после димеризации. SIM был успешно завербован в теломеры, и фокусы SIM и TRF-1 стали больше и ярче, как и прогнозировалось для образования и роста капель жидкости. Кроме того, наблюдалось слияние очагов TRF-1, что приводило к кластеризации теломер, о чем свидетельствует уменьшение числа теломер и увеличение интенсивности теломер с течением времени.
Напротив, SIM-мутант был рекрутирован в теломеры после димеризации, но не индуцировал образование капель или кластеризацию теломер, что указывает на то, что разделение фаз и кластеризация теломер обусловлены взаимодействиями SUMO-SIM. Изменение разделения фаз и кластеризации теломер наблюдалось после добавления избыточного свободного ТМЗ. Число теломер увеличивалось, а интенсивность теломер со временем уменьшалась.
Репрезентативные изображения APB, идентифицированных теломерной ДНК FISH и белка PML IF, показаны здесь. Клетки с набранной SIM-картой имеют больше ADB, чем клетки с набранным SIM-мутантом, предполагая, что конденсаты, индуцированные димеризацией, действительно являются APB. При выполнении этого протокола не подвергайте светочувствительные димеризаторы воздействию света.
Работайте в темном помещении с лампой, которая излучает красный свет и оберните клетки алюминиевой фольгой во время инкубации. Следуя этой процедуре, бесконтактная маркировка может быть использована для создания полного списка компонентов в индуцированном конденсате. Живая визуализация может быть использована для отслеживания динамики компонентов в конденсате.
Эти методы могут помочь определить роли управления контролем состава конденсата.
