Измерение внутренней частоты сердечных сокращений является важным показателем здоровья сердца. Этот метод точно измеряет эту скорость, исключая большинство смешанных влияний на синоатриальный узел. Запись MEA внутреннего сердечного ритма захватывает точные данные о скорости срабатывания, аналогичные одноклеточным записям без обширной электрофизиологической подготовки.
Люди, использующие этот метод, могут изо всех сил пытаться получить препараты здоровой ткани в ранних экспериментах, поэтому практикуйте вскрытие и оптимизируйте буферы и настройки сбора данных, прежде чем начинать реальный сбор данных. Продемонстрировать процедуру будут доктора Ман Си и Правин Кумар, постдокторанты в моей лаборатории. Начните с удержания кожи усыпленной мыши гемостатом и используйте хирургические ножницы, чтобы сделать поперечный разрез в коже прямо под нижней частью грудной клетки от левой реберной дуги до правой реберной дуги.
Используйте хирургические ножницы, чтобы разрезать брюшину и осторожно отделить печень от диафрагмы без прокола печени, чтобы предотвратить чрезмерное кровотечение. Разрезайте диафрагму вдоль грудной клетки, чтобы обнажить грудную полость. Используйте хирургические ножницы, чтобы разрезать боковые стенки грудной клетки от краев реберных дуг до клавиц, чтобы обнажить сердце, затем используйте иглу шприца 23 калибра, чтобы закрепить грудную клетку через плечо.
Используйте переносную пипетку, чтобы нанести теплый гепаринизированный полный раствор Тирода на сердце, чтобы сохранить его влажным. Удерживайте легкие с помощью очень тонких щипцов Graefe и разорвите трахею хирургическими ножницами, чтобы удалить легкие. Для удаления сердца удерживайте верхушку сердца с помощью дополнительных тонких щипцов Graefe и разрезайте аорту и нижнюю полую вену хирургическими ножницами.
Переложите сердце в чашку Петри, содержащую отвержденный силиконовый эластомер, и используйте переносную пипетку для купания сердца с двумя-тремя миллилитрами теплого гепаринизированного полного раствора Тирода. Прикрепите верхушку сердца к блюду с помощью рассеченной булавки. Удерживайте нижнюю полую вену с помощью щипцов дюмона 2 силами ламинэктомии.
Вставьте иглу шприца 22 калибра через нижнюю и верхнюю полую вену, чтобы найти их положение в правом предсердии, что также определяет приблизительное положение синоатриального узла. Удерживайте правый предсердный придаток с помощью щипцов для ламинэктомии Дюмона 2 и вставьте рассеченный штифт через правый предсердный придаток, чтобы удержать его на месте. Повторите ту же процедуру для придатка левого предсердия, затем удалите шприцевую иглу, которая охватывает вену.
Используйте ножницы Castroviejo, чтобы удалить верхушку сердца, сделав поперечный разрез через желудочки для высвобождения крови из сердца, а затем промыть сердце, добавив теплый гепаринизированный полный раствор Тирода. Используйте ножницы Castroviejo, чтобы разрезать вдоль атриовентрикулярной перегородки до тех пор, пока предсердия не отделятся от желудочков и держать разрез ближе к желудочку. Разрезать вдоль межартериальной перегородки, чтобы удалить левое предсердие.
Поместите рассеченные штифты на периферию правого предсердия, чтобы он лежал ровно. Удалите оставшийся жир, сосуды или ткани из предсердия с помощью ножниц Castroviejo и найдите синоатриальный узел в правом предсердии. Добавьте раствор Тирода в модель входного раствора и включите поток карбогенного газа для насыщения раствора Тирода кислородом.
Установите перистальтический насос на 25 об/мин, что дает скорость потока два миллилитра в минуту. После запуска насоса убедитесь, что буфер не просачивается из системы, и установите регулятор температуры на 37 градусов цельсия. Используйте щипцы Дюмона 55 для переноса рассеченной ткани из рассекающей чашки Петри на сетку микроэлектродного массива.
Аккуратно расположите ткань мягкой кистью, чтобы наложить область синоатриального узла электродной сетки. Затем поместите сетку на ткань, используя костные щипцы или любые изогнутые щипцы. Используя костные щипцы, расположите якорь арфы на сетке, чтобы удерживать все на месте.
Расположите микроэлектродную решетку на соединительной пластине. Аккуратно поместите перфузионный колпачок на тарелку с микроэлектродным массивом, не нарушая якорь ломтика арфы, и закрепите перфузионный зазор скотчем. Включите усилитель и настройте рабочий процесс для записи в программном обеспечении.
Выберите beat_recording. шаблон moflo. Откройте его и установите количество трассировок, длительность трассировки, интервал трассировки, входное напряжение, частоту дискретизации и другие параметры записи в соответствии с желаемыми условиями записи.
Нажмите кнопку записи и воспроизведения, чтобы начать запись и получить данные для 10 трасс продолжительностью в одну минуту с интервалами в две минуты между трассировками. Приостановите насос и переключите втулку насоса с обычного регистрируемого раствора на раствор Тирода, содержащий желаемый препарат по выбору. Перезапустите насос и возобновите запись.
После того, как раствор Тирода, наполненный лекарственным средством, достиг ткани, запишите 10 следов таким же образом, как это было сделано ранее для исходных записей. Сделайте окончательный снимок положения ткани на микроэлектродной матрице. Откройте сохраненный файл записанных данных в шаблоне анализа частоты ударов программного обеспечения для анализа.
Нажмите на воспроизведение и позвольте всей записи запуститься для визуализации данных, а затем назначьте соответствующие параметры анализа. Выберите каналы для включения в анализ и установите требуемые максимальные значения амплитуды или минимальных значений амплитуды для автоматической идентификации пика формы сигнала. Нажмите на значок воспроизведения еще раз, чтобы повторно запустить набор данных и убедиться, что параметры анализа подходят для извлечения пиков.
Для анализа определите три наиболее стабильных последовательных следа, которые демонстрируют стабильную скорость биения для каждого следа по большинству каналов в течение базового периода эксперимента и еще три последовательных стабильных следа в течение периода воздействия наркотиков. Щелкните значок воспроизведения и записи, чтобы начать анализ. Данные были собраны у 45-дневного самца черной швейцарской мыши дикого типа для измерения частоты ударов синоатриального узла.
Формы сигналов с различными формами и амплитудами наблюдались в разных каналах, и все каналы показывали одинаковые интервалы между ударами и частоты выстрела. Однако степень контакта ткани с электродом может также влиять на характеристики формы сигнала, такие как амплитуда. Из 10 записанных следов для дальнейшего анализа были выбраны три последовательных канала со стабильной частотой биения и интервалом между ударами.
Плохо извлеченные паттерны шипов должны отсутствовать, но если они присутствуют, либо находятся под влиянием шума, либо нестабильны. Формы сигналов, которые соответствуют индивидуальным сердечным сокращениям, отражают внутреннюю активность кардиостимулятива. Система микроэлектродной матрицы позволяет легко применять лекарственные средства для анализа фармакологических эффектов.
Внутренняя скорость стрельбы выбранных трех следов по всем 64 каналам была обнаружена примерно в 320 ударов в минуту в данных выборки. Введение 4-аминопиримидина увеличило интервалы между ударами, как и ожидалось, что уменьшило частоту ударов с 320 до 210 ударов в минуту. Чтобы собрать надежные данные для анализа, важно подтвердить, что ткань здорова во время записи, проверив, что следы стабильны и соответствуют стандартным критериям.
MEA могут использоваться для регистрации сердечной деятельности в других областях сердца, что позволяет получить подробную характеристику для конкретного региона, которая поддается изучению эффектов генетических и фармакологических манипуляций.
