Этот метод обеспечивает быстрое, высокопроизводительное обнаружение прилипания бактерий к клеткам-хозяевам. По сравнению с обычными методами покрытия, это сокращает практическое время, необходимое для количественной оценки адгезивных бактерий. Этот метод автоматизирован, экономит время и очень воспроизводим.
Он также широко применяется как к большинству клеток-хозяев. Этот метод, есть очень простой. Для первого испытания необходимо оптимизировать такие условия, как множественность инфекции, а также время совместной инкубации бактерий-хозяев.
Сначала собирают бактериальные культуры в экспоненциальной фазе путем центрифугирования в 13 000 раз G в течение двух минут при комнатной температуре. После промывки поддона клеток одним миллилитром PBS повторно суспендируют бактериальную палитру в одном миллилитре PBS. Определение концентраций бактериальной суспензии путем измерения оптической плотности на 600 нанометров.
Затем, для окрашивания бактериальной суспензии, добавьте два микролитра 500-кратного концентрированного зеленого или красного окрашивающего красителя в один миллилитр бактериальной суспензии, чтобы разбавить краситель в одну складку. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 30 минут с легким вращением в темноте. Через 30 минут центрифугируют окрашенные бактерии в 13 000 раз G в течение двух минут и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре PBS.
Соберите окрашенные бактериальные клетки путем центрифугирования при 13 000 G в течение двух минут. Повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре свежей среды F12 K и измеряют оптическую плотность каждой культуры на уровне 600 нанометров. Впоследствии разбавляют культуры до нужных концентраций на основе множественности инфекции и концентрации клеток-хозяев.
Для анализа бактериальной приверженности промыть ранее культивируемые монослои клеток A549 три раза, добавив 100 микролитров теплого PBS в каждую лунку и осторожно пипетку вверх и вниз. Затем отбросьте PBS. Кроме того, после добавления PBS подождите 10 секунд, а затем удалите PBS с помощью вакуума.
Чтобы определить кинетику бактериальной ассоциации, накладывают на клетки 100 микролитров желаемых концентраций бактериальной суспензии с разной кратностью инфекции. Раскрутите бактерии и инкубируйте инфицированные клетки A549 при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение дополнительного одного часа. Удалите несвязанные бактерии, промыв монослои пять раз теплым PBS, как показано на рисунке.
Затем зафиксируйте ячейки, добавив 100 микролитров 4% формальдегида во все колодцы 96-луночной пластины на льду. Через 15 минут трижды промойте пластину PBS, чтобы удалить раствор для фиксации. Окрашивание в ядра с 50 нанограммами на миллилитр пятна DAPI в течение 10 минут при комнатной температуре.
После промывки клеток PBS накройте инфицированные клетки A549 100 микролитрами PBS, чтобы избежать высыхания, а затем храните пластину при четырех градусах Цельсия в течение двух дней в темноте или приступайте к визуализации. Чтобы сохранить целостность данных, случайным образом и вручную выберите пять мест каждой скважины, чтобы захватить изображения с 20-кратным увеличением. Захват флуоресцентных изображений бактерий под каналами GFP, клеток A549 под DAPI, а для бактерий, окрашенных красным флуоресцентным красителем, используйте пятиканальный PE Si.
Установите параметры катящегося шара для сглаживания и автоматически измерьте функцию точечного распространения деконволюции изображения на основе цели достижения лучшего разрешения. Измерьте интенсивность флуоресценции клеток-хозяев и бактерий. Установите самую слабую интенсивность флуоресценции клеток-хозяев и бактерий в качестве пороговых значений для подсчета клеток и подсчитайте все бактерии, находящиеся рядом с клеткой-хозяином на расстоянии 15 микрометров, как бактерии адгезии.
После того, как клетки были подсчитаны из всех автоматизированных изображений, проанализируйте критические показания, такие как количество клеток-хозяев, размеры и формы клеток, общее количество бактерий и средний учет бактерий на клетку-хозяина, что является наиболее важным показателем для определения бактериальной приверженности. После одного часа совместной инкубации штамм pseudomonas aeruginosa PAO1 прилипал к клеткам A549 в зависимости от дозы. Аналогичные результаты наблюдались и при грамположительных бактериях listeria monocytogenes и ее отрицательном контроле bacillus subtilis.
Репрезентативное изображение сегментации P aeruginosa хозяина демонстрирует легкость подсчета бактериальных клеток с использованием этого протокола. Результаты автоматизированного анализа включают количество бактериальных клеток и клеток-хозяев, среднее количество бактерий на клетку-хозяина и размеры клеток-хозяев и области, представляющие состояние здоровья клеток-хозяев, уровень бактериальной приверженности и бактериальную цитоксичность. Помимо ячеек A549, HUVEC также были протестированы для анализа адгезии.
Serratia rubidaea и streptococcus agalactiae были привержены HUVEC, но не клеткам A549, и что демонстрирует эффективное обнаружение и пригодность нескольких хозяев для изучения взаимодействия бактерий-хозяев с использованием этого метода. Клетки-хозяева должны достигать от 90 до 100% слияния, чтобы свести к минимуму прилипание нежелательных бактерий к дну скважин. Этот метод позволит исследователям исследовать новые механизмы, взаимодействия хозяина и вредителя.
