שיטה זו מספקת זיהוי מהיר, תפוקה גבוהה של דבקות חיידקים לתאים מארחים. בהשוואה לשיטות ה ציפוי הקונבנציונליות, זה להפחית את הזמן הידיים על הנדרש לכימות של חיידקים דבקים. טכניקה זו היא אוטומטית, חוסכת זמן ו ניתנת לשחזור רב.
זה גם מיושם באופן נרחב הן על רוב התאים המארחים. שיטה זו, יש מאוד פשוטה. לניסוי הראשון, יש אופטימיזציה של התנאים כמו ריבוי הזיהום, וגם זמן הדגירה המשותפת של החיידקים המארחים.
ראשית לקצור את תרביות החיידקים בשלב מעריכי על ידי צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת משטח התאים עם PBS מיליליטר אחד, resuspend פלטת החיידקים ב PBS מיליליטר אחד. לקבוע את הריכוזים של השעיה חיידקית על ידי מדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר.
לאחר מכן, להכתמת ההשעיה החיידקית, הוסיפו שני מיקרוליטרים של צבע הכתמים המרוכז של 500 המניות הירוק או האדום למיליליטר אחד של השעיית חיידקים כדי לדלל את הצבע קיפול אחד. לדגור על התאים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות עם סיבוב עדין בחושך. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה החיידקים המוכתמים ב 13, 000 פעמים G במשך שתי דקות ו resuspened הכדור במיליליטר אחד של PBS.
לאסוף את תאי החיידקים מוכתמים על ידי צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים G במשך שתי דקות. resuspend הכדור במיליליטר אחד של בינוני F12 K טרי ולמדוד את הצפיפות האופטית של כל תרבות ב 600 ננומטר. לאחר מכן לדלל את התרבויות לריכוזים הרצויים בהתבסס על ריבוי הזיהום וריכוז התא המארח.
עבור דבקות חיידקית Assay, לשטוף את שכבות מונו תא A549 בתרבית בעבר שלוש פעמים על ידי הוספת 100 microliters של PBS חם לכל באר בעדינות pipette למעלה ולמטה. לאחר מכן השלך PBS. לחלופין, לאחר הוספת PBS, המתן 10 שניות ולאחר מכן הסר PBS באמצעות ואקום.
כדי לקבוע את הקינטיקה של אסוציאציה חיידקית, לכסות את התאים עם 100 microliters של ריכוזים הרצויים של השעיה חיידקית עם ריבוי שונה של זיהום. לסובב את החיידקים ולדגירה את תאי A549 נגועים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת נוספת. הסר את החיידקים הלא מאוגדים על ידי שטיפת שכבות מונו חמש פעמים עם PBS חם כפי שהוכח.
לאחר מכן, לתקן את התאים על ידי הוספת 100 microliters של 4% פורמלדהיד בכל הבארות של צלחת 96 באר על הקרח. לאחר 15 דקות, לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את פתרון הקיבעון. כתם בגרעינים עם 50 ננוגרם למיליליטר כתם DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר שטיפת התאים עם PBS, לכסות את תאי A549 נגועים עם 100 microliters של PBS כדי למנוע ייבוש ולאחר מכן לאחסן את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס עד יומיים בחושך או להמשיך להדמיה. כדי לשמור על שלמות הנתונים, בחר באופן אקראי ובאופן ידני חמישה מיקומים של כל באר כדי ללכוד את התמונות בהגדלה של פי 20. ללכוד את התמונות הפלואורסצנטיות של חיידקים תחת ערוצי GFP, תאי A549 תחת DAPI, ועל החיידקים מוכתמים על ידי צבע פלואורסצנטי אדום להשתמש PE Si חמש ערוץ.
הגדר את הפרמטרים של הכדור המתגלגל להחלקת ומדוד אוטומטית את פונקציית התפשטות הנקודות של דה-וולוציה של תמונה בהתבסס על המטרה להשגת רזולוציה טובה יותר. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של התאים המארחים והחיידקים. הגדר את עוצמת הפלואורסצנטיות החלשה ביותר של תאים מארחים וחיידקים כסף לספירת התאים וספור את כל החיידקים הקרובים לתא מארח במרחק של 15 מיקרומטר כחיידק הדבקות.
לאחר שהתאים נספרו מכל התמונות האוטומטיות, ניתחו קריאות קריטיות, כגון ספירת תאים מארחים, גדלי תאים וצורות, ספירת חיידקים כוללת וחשבון חיידקי ממוצע לכל תא מארח, שהוא האינדיקטור החשוב ביותר לקביעת דבקות חיידקית. לאחר שעה אחת של דגירה משותפת, פסאודומונס aeruginosa זן PAO1 דבק בתאי A549 בצורה תלויה במינון. תוצאות דומות נצפו גם כאשר חיידקים חיוביים גרם ליסטריה monocytogenes ואת השליטה השלילית שלה bacillus subtilis.
תמונה מייצגת של פילוח P aeruginosa חסיד מארח מדגימה את הקלות של ספירת תאים חיידקיים באמצעות פרוטוקול זה. התוצאות של הניתוחים האוטומטיים כוללות ספירת תאים חיידקיים וארחים, ספירת החיידקים הממוצעת לכל תא מארח וגדלי תאים מארחים ואזורים המייצגים את מצב בריאות התא המארח, רמת הדבקות החיידקית ורעילות ציטו חיידקית. מלבד תאי A549, HUVECs נבדקו גם לבדיקת דבקות.
Serratia rubidaea ו streptococcus agalactiae היו דבקים HUVEC, אבל לא לתאי A549, אשר מדגים את הזיהוי היעיל ואת ההתאמה של מארחים מרובים ללמוד את אינטראקציות חיידקים המארחים באמצעות שיטה זו. תאים מארחים צריכים להגיע סביב 90 עד 100% מפגש כדי למזער את דבקות החיידקים הבלתי רצויים בתחתית בארות. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לחקור את המנגנונים החדשים, אינטראקציות המזיקים המארחים.
