Questo metodo fornisce un rilevamento rapido e ad alto rendimento dell'aderenza dei batteri alle cellule ospiti. Rispetto ai metodi di placcatura convenzionali, riduce il tempo pratico necessario per la quantificazione dei batteri aderenti. Questa tecnica è automatizzata, fa risparmiare tempo e molto riproducibile.
È anche ampiamente applicato sia alla maggior parte delle cellule ospiti. Questo metodo, c'è molto semplice. Per il primo studio, le condizioni come la molteplicità dell'infezione e anche il tempo di co-incubazione dei batteri ospiti devono essere ottimizzati.
Per prima cosa raccogliere le colture batteriche in fase esponenziale mediante centrifugazione a 13.000 volte G per due minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato il pallet di celle con un MILLILITRO PBS, risospesere la tavolozza batterica in un millilitro PBS. Determinare le concentrazioni di sospensione batterica misurando la densità ottica a 600 nanometri.
Quindi, per colorare la sospensione batterica, aggiungere due microlitri del colorante colorante colorante verde o rosso concentrato 500 volte in un millilitro di sospensione batterica per diluire il colorante una piega. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti con una leggera rotazione al buio. Dopo 30 minuti, centrifugare i batteri colorati a 13.000 volte G per due minuti e risospescere il pellet in un millilitro di PBS.
Raccogliere le cellule batteriche colorate mediante centrifugazione a 13.000 volte G per due minuti. Risospesare il pellet in un millilitro di mezzo fresco F12 K e misurare la densità ottica di ciascuna coltura a 600 nanometri. Successivamente diluire le colture alle concentrazioni desiderate in base alla molteplicità dell'infezione e della concentrazione della cellula ospite.
Per il test di aderenza batterica, lavare tre volte gli strati monocellulari A549 precedentemente coltivati aggiungendo 100 microlitri di PBS caldo a ciascun pozzetto e pipettare delicatamente su e giù. Quindi scartare PBS. In alternativa, dopo aver aggiunto PBS, attendere 10 secondi e quindi rimuovere PBS utilizzando il vuoto.
Per determinare la cinetica dell'associazione batterica, sovrapporre le cellule con 100 microlitri delle concentrazioni desiderate di sospensione batterica con diverse molteplicità di infezione. Spin down i batteri e incubare le cellule A549 infette a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per un'ulteriore ora. Rimuovere i batteri non legati lavando gli strati mono cinque volte con PBS caldo come dimostrato.
Quindi, fissare le cellule aggiungendo 100 microlitri di formaldeide al 4% in tutti i pozzetti di una piastra da 96 pozzi sul ghiaccio. Dopo 15 minuti, lavare la piastra tre volte con PBS per rimuovere la soluzione di fissaggio. Colorazione nei nuclei con 50 nanogrammi per millilitro di colorazione DAPI per 10 minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver lavato le cellule con PBS, coprire le cellule A549 infette con 100 microlitri di PBS per evitare l'essiccazione e quindi conservare la piastra a quattro gradi Celsius per un massimo di due giorni al buio o procedere per l'imaging. Per mantenere l'integrità dei dati, scegli in modo casuale e manuale cinque posizioni di ciascun pozzo per acquisire le immagini con un ingrandimento di 20 volte. Cattura le immagini fluorescenti dei batteri sotto i canali GFP, le cellule A549 sotto DAPI e per i batteri macchiati dal colorante fluorescente rosso usa PE Si cinque canali.
Impostare i parametri della palla rotante per la levigatura e misurare automaticamente la funzione di diffusione del punto della deconvoluzione dell'immagine in base all'obiettivo di ottenere una risoluzione migliore. Misurare l'intensità di fluorescenza delle cellule ospiti e dei batteri. Impostare l'intensità di fluorescenza più debole delle cellule ospiti e dei batteri come soglie per il conteggio cellulare e contare tutti i batteri vicini a una cellula ospite entro 15 micrometri di distanza come batteri di aderenza.
Una volta che le cellule sono state contate da tutte le immagini automatizzate, analizzare le letture critiche, come i conteggi delle cellule ospiti, le dimensioni e le forme delle cellule, le conteggie batteriche totali e il conto batterico medio per cellula ospite, che è l'indicatore più importante per determinare l'aderenza batterica. Dopo un'ora di co-incubazione, pseudomonas aeruginosa ceppo PAO1 ha aderito alle cellule A549 in modo dose-dipendente. Risultati simili sono stati osservati anche quando i batteri gram-positivi listeria monocytogenes e il suo controllo negativo bacillus subtilis.
Un'immagine rappresentativa della segmentazione dell'aeruginosa P aderente all'ospite dimostra la facilità di contare le cellule batteriche utilizzando questo protocollo. I risultati delle analisi automatizzate includono la conta batterica e delle cellule ospiti, la conta batterica media per cellula ospite e le dimensioni e le aree delle cellule ospiti che rappresentano lo stato di salute delle cellule ospiti, il livello di aderenza batterica e la tossicità citossicità batterica. Oltre alle cellule A549, gli HUVEC sono stati testati anche per il test di aderenza.
Serratia rubidaea e streptococcus agalactiae erano aderenti a HUVEC, ma non alle cellule A549, e ciò dimostra l'efficace rilevamento e l'idoneità di più ospiti a studiare le interazioni dei batteri ospiti utilizzando questo metodo. Le cellule ospiti dovrebbero raggiungere circa il 90-100% di confluenza per ridurre al minimo l'aderenza dei batteri indesiderati al fondo dei pozzetti. Questa tecnica permetterà ai ricercatori di esplorare i nuovi meccanismi, le interazioni ospite-parassita.
