Diese Methode ermöglicht einen schnellen Hochdurchsatz-Nachweis der Bakterienadhärenz an Wirtszellen. Im Vergleich zu den herkömmlichen Beschichtungsmethoden reduziert es die praktische Zeit, die für die Quantifizierung der adhärenten Bakterien benötigt wird. Diese Technik ist automatisiert, zeitsparend und sehr reproduzierbar.
Es ist auch weit verbreitet, sowohl auf die meisten Wirtszellen als auch auf die meisten Wirtszellen angewendet. Diese Methode ist sehr einfach. Für den ersten Versuch müssen die Bedingungen wie die Vielzahl der Infektionen und auch die Co-Inkubationszeit der Wirtsbakterien optimiert werden.
Ernten Sie die Bakterienkulturen zunächst in einer exponentiellen Phase durch Zentrifugation bei 13.000 mal G für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellenpalette mit einem Milliliter PBS gewaschen haben, versenken Sie die Bakterienpalette in einem Milliliter PBS. Bestimmen Sie die Konzentrationen der Bakteriensuspension durch Messung der optischen Dichte bei 600 Nanometern.
Dann, um die Bakteriensuspension zu färben, fügen Sie zwei Mikroliter des 500-fach konzentrierten brühigen grünen oder roten Färbefarbstoffs in einen Milliliter Bakteriensuspension hinzu, um den Farbstoff einfach zu verdünnen. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 30 Minuten mit sanfter Rotation im Dunkeln. Nach 30 Minuten die gefärbten Bakterien bei 13.000 mal G für zwei Minuten zentrifugieren und das Pellet in einem Milliliter PBS resuspenieren.
Sammeln Sie die gefärbten Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 13.000 mal G für zwei Minuten. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem F12 K-Medium und messen Sie die optische Dichte jeder Kultur bei 600 Nanometern. Anschließend verdünnen Sie die Kulturen auf die gewünschten Konzentrationen basierend auf der Vielzahl der Infektion und der Wirtszellkonzentration.
Waschen Sie für den Bacterial Adherence Assay die zuvor kultivierten A549-Zellmonoschichten dreimal, indem Sie 100 Mikroliter warmes PBS in jede Vertiefung geben und vorsichtig auf und ab pipettieren. Verwerfen Sie dann PBS. Alternativ können Sie nach dem Hinzufügen von PBS 10 Sekunden warten und dann PBS mit Vakuum entfernen.
Um die Kinetik der bakteriellen Assoziation zu bestimmen, überlagern Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern gewünschter Konzentrationen der Bakteriensuspension mit unterschiedlicher Vielzahl von Infektionen. Drehen Sie die Bakterien herunter und inkubieren Sie die infizierten A549-Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für eine weitere Stunde. Entfernen Sie die ungebundenen Bakterien, indem Sie die Monoschichten fünfmal mit warmem PBS waschen, wie gezeigt.
Als nächstes fixieren Sie die Zellen, indem Sie 100 Mikroliter 4% Formaldehyd in alle Vertiefungen einer 96-Well-Platte auf dem Eis geben. Nach 15 Minuten waschen Sie die Platte dreimal mit PBS, um die Fixierlösung zu entfernen. Färbung in den Kernen mit 50 Nanogramm pro Milliliter DAPI-Färbung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Nachdem Sie die Zellen mit PBS gewaschen haben, bedecken Sie die infizierten A549-Zellen mit 100 Mikrolitern PBS, um ein Trocknen zu vermeiden, und lagern Sie die Platte dann bei vier Grad Celsius bis zu zwei Tage im Dunkeln oder fahren Sie mit der Bildgebung fort. Um die Datenintegrität zu erhalten, wählen Sie zufällig und manuell fünf Positionen jeder Vertiefung aus, um die Bilder mit der 20-fachen Vergrößerung aufzunehmen. Erfassen Sie die fluoreszierenden Bilder von Bakterien unter GFP-Kanälen, A549-Zellen unter DAPI und für die Bakterien, die mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff gefärbt werden, verwenden Sie PE Si fünf Kanäle.
Stellen Sie die Parameter des Rollballs für die Glättung ein und messen Sie automatisch die Punktspreizungsfunktion der Bilddekonvolution basierend auf dem Ziel, eine bessere Auflösung zu erreichen. Messen Sie die Fluoreszenzintensität der Wirtszellen und Bakterien. Stellen Sie die schwächste Fluoreszenzintensität von Wirtszellen und Bakterien als Schwellenwerte für die Zellzahl ein und zählen Sie alle Bakterien, die in der Nähe einer Wirtszelle innerhalb von 15 Mikrometern Entfernung liegen, als Adhärenzbakterien.
Sobald die Zellen aus allen automatisierten Bildern gezählt wurden, analysieren Sie kritische Messwerte wie Wirtszellzahlen, Zellgrößen und -formen, Gesamtbakterienzahlen und das durchschnittliche Bakterienkonto pro Wirtszelle, das der wichtigste Indikator für die Bestimmung der Bakterienadhärenz ist. Nach einer Stunde Co-Inkubation haftete der Pseudomonas aeruginosa-Stamm PAO1 dosisabhängig an A549-Zellen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei grampositiven Bakterien listeria monocytogenes und deren Negativkontrolle Bacillus subtilis beobachtet.
Ein repräsentatives Bild der wirtsadhärenten P aeruginosa-Segmentierung zeigt die Leichtigkeit der Zählung von Bakterienzellen mit diesem Protokoll. Die Ergebnisse der automatisierten Analysen umfassen Bakterien- und Wirtszellzahlen, die durchschnittliche Keimzahl pro Wirtszelle und Wirtszellgrößen und -bereiche, die den Status der Wirtszellgesundheit darstellen, bakterielle Adhärenz und bakterielle Zytotoxizität. Neben A549-Zellen wurden HUVECs auch auf Adhärenztest getestet.
Serratia rubidaea und Streptococcus agalactiae hafteten an HUVEC, aber nicht an A549-Zellen, was den effektiven Nachweis und die Eignung mehrerer Wirte zur Untersuchung der Wirtsbakterieninteraktionen mit dieser Methode zeigt. Wirtszellen sollten etwa 90 bis 100% Konfluenz erreichen, um die unerwünschten Bakterien, die am Boden der Vertiefungen haften, zu minimieren. Diese Technik wird es den Forschern ermöglichen, die neuen Mechanismen, die Wirt-Schädlings-Interaktionen, zu erforschen.
