Этот простой протокол позволяет маркировать электромобили и контролировать их с помощью конфокальной микроскопии. Например, визуализация EV может помочь в оценке распределения EV при использовании его в терапии. Этот метод позволяет легко контролировать миграцию и поглощение EV в эксплантатах хряща с помощью конфокальной микроскопии без какой-либо специальной функции.
Тот же протокол может быть использован для электромобилей для экспериментов in vitro или in vivo. Убедитесь, что колонны подготовлены заранее, и что начального объема EV достаточно для достижения желаемой конечной концентрации частиц, учитывая, что около 10% частиц будет потеряно на этапе очистки. Начните с концентрации внеклеточного везикула, или EV, образца и контроля.
Поместите образцы в концентрирующую трубку объемом 15 миллилитров или 500 микролитров, в зависимости от начального объема образца EV. Центрифугируйте трубки в соответствии с инструкциями производителя до получения почти сухого образца. Повторно суспендировать концентрированные образцы EV с 200 микролитрами и контрольную группу со 100 микролитрами разбавителя C и перенести их в новые 1,5-миллилитровые центрифужные трубки.
Разделите образец EV на две аликвоты по 100 микролитров каждая. Пометьте одну из аликвоток красителем и используйте ее в качестве лечения. Оставьте другой без маркировки, но обработайте его как образец EV и используйте его для количественной оценки концентрации EV с помощью анализа отслеживания наночастиц.
Готовят 2x раствор красителя таким образом, чтобы полученная концентрация раствора PKH26 в разбавителе C составляла восемь микромоляров. Смешайте один микролитр одномиллимолярного линкера PKH26 на 125 микролитр разбавителя C в образце. Подготовьте объем, необходимый для добавления к образцам в соотношении 1:1.
Добавьте 2-кратный раствор красителя к ПВ, полученным из лизата тромбоцитов PKH, и контрольные образцы в соотношении 1:1 для достижения 1-кратной концентрации красителя и четырехмикролярной концентрации PKH26. Добавьте тот же объем PBS в образец EV, полученный из лизата тромбоцитов NTA. Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре.
Добавьте 5% раствор альбумина-PBS из бычьей сыворотки в образцы в соотношении 1:1 и убедитесь, что конечный объем составляет приблизительно 400 микролитров. Перейдите к отделению маркированных электромобилей от несвязанных красителей и неспецифических взаимодействий красителя с колонкой. Снимите колпачок с колонки, добавьте 400 микролитров EVs, полученных из лизата тромбоцитов PKH, EV, полученных из лизата тромбоцитов NTA, или контролируйте и выбрасывайте всю элюированную жидкость.
Подождите, пока образец полностью войдет в столбец, прежде чем переходить к следующему шагу. Добавьте 600 микролитров PBS и выбросьте всю элюированную жидкость. Подождите, пока PBS полностью войдет в столбец, прежде чем переходить к следующему шагу.
Добавьте 600 микролитров PBS и соберите долю 600 микролитров в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку. Для новой колонки повторите шаги, связанные с концентрацией образцов, упомянутых в начале протокола. Добавьте в колонку 600 микролитров ранее элюированных электромобилей и отбросьте элюированный объем.
Затем добавьте 400 микролитров PBS и выбросьте все элюированные объемы. Добавьте 600 микролитров PBS в колонку и соберите долю 600 микролитров в 1,5-миллилитровой центрифужной трубке. Дважды промыть хрящ PBS и иссечь его с помощью биопсийного пунша диаметром три миллиметра в стерильных условиях.
Поместите экспланты в 96-луночные культуральные пластины со средой DMEM-F12, дополненной 1% пенициллина стрептомицина при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 и влажности 80%. Чтобы установить модель ОА, основанную на воспалении, дополните среду клеточной культуры 10 нанограммами на миллилитр онкостатина M и двумя нанограммами на миллилитр фактора некроза опухоли-альфа. Обрабатывайте экспланты 1-кратно 10-9-ми частицами на лунку РХ, полученных из лизата тромбоцитов PKH, или контрольными, в среде клеточной культуры, дополненной онкостатином М и фактором некроза опухоли-альфа.
Удалите среду из 96-луночных пластин для культивирования клеток, содержащих хрящевые экспланты. Добавьте 200 микролитров клеточной питательной среды к каждой скважине, как описано в рукописи. Прекращайте анализ in vitro каждый час от нуля до пяти часов.
Промыть клетки культуры колодцами, содержащими экспланты хряща, два раза 200 микролитрами PBS. Добавьте 100 микролитров 4% параформальдегида в ткань, чтобы зафиксировать его в течение трех часов при четырех градусах Цельсия. Удалите PFA, добавьте 100 микролитров PBS, сохраните фиксированную ткань при четырех градусах Цельсия и обработайте образцы в течение 48 часов.
Изображения, сделанные в разные моменты времени, показывают, как EV проникают в ткань, пока они не достигнут хондроцитов, и со временем попадают в хондроциты. Меченые EV уже локализовались вокруг хондроцитов после одного часа инкубации. Убедитесь, что начального объема электромобилей достаточно для достижения желаемой конечной концентрации частиц.
Еще одна важная вещь, которую следует помнить, - это использовать помеченные электромобили в течение следующих 24 часов. Если не использовать его в течение 24 часов, может произойти снижение флуоресценции. Этот метод поможет исследователям улучшить визуализацию электромобилей и изучить EV в биологии и терапии.
