Мы представляем протокол для получения большого количества экзосом GMP-класса из мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости с использованием нашего 3D-биореактора. Эти экзосомы могут быть использованы в исследованиях биологии экзосом и клинического лечения артрита. Демонстрировать процедуру будет доктор Юйцзе Лян.
Начните собирать мезенхимальные клетки человека, или МСК, центрифугируя синовиальную жидкость в 1 500 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования отбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки 10 миллилитрами PBS. Центрифугируйте повторно суспендированные клетки в 1 500 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и отбросьте PBS перед повторным использованием гранулы с 10 миллилитрами питательной среды MSC человека при плотности клеток от пяти раз 10 до четвертой клетки на миллилитр, а затем поместите суспензию в 100-миллиметровую чашку.
Инкубируйте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Через две недели соберите супернатант клеточной культуры для идентификации мезенхимальных стволовых клеток синовиальной жидкости или SF-МСК с помощью проточной цитометрии. Для этого переварите третье поколение прохождения трех SF-МСК центрифугированием в 1000 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.
Затем выбросьте супернатант перед сбором гранулы клетки. Далее добавляют 400 микролитров блокирующего буфера в ячейку гранулы в концентрации от пяти раз 10 до четвертой и дают грануле постоять 15 минут при комнатной температуре. Через 15 минут центрифугируют клеточную суспензию, как описано ранее, затем повторно суспендируют отделенную гранулу в 100 микролитрах 1X PBS.
Добавьте один микролитр моноклонального флуоресцентного антитела при соотношении разведения 1:100 на пробирку, как описано в рукописи, и поместите пробирку для инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации дважды промывайте клетки 1X PBS и повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах 1X PBS. Затем обнаружите флуорофоры в 10 000 клетках на проточном цитометре с использованием красного и FITC каналов.
Для приготовления микроносителей набухают и увлажняют сухими 0,75 г микроносителей в 1X DPBS в концентрации 50 миллиграмм на грамм в течение не менее трех часов при комнатной температуре. Затем декантируйте супернатант для мытья микроносителей в свежем DPBS в течение пяти минут. После замены среды свежим 1X DPBS при 50 миллиграммах микроносителей на грамм, стерилизуйте микроносители автоклавированием при 121 градусе Цельсия в течение 15 минут при 15 фунтах на квадратный дюйм.
Затем дайте стерилизованным микроносителям осесть перед декантацией супернатанта. Микроносители промыть в питательной среде в концентрации 50 миллиграмм микроносителей на грамм при комнатной температуре. Когда микронесущие осядут, выбросьте супернатант.
Чтобы приготовить перфузионный биореактор, стерилизуйте биореактор путем автоклавирования, как описано ранее. Когда это будет сделано, подсчитайте количество SF-МСК, чтобы выделить 2,5 раза 10 седьмым SF-МСК и микроносителям биореактора, перфузированного 250 миллилитрами питательной среды MSC класса GMP. Поместите биореактор в инкубатор с 5% углекислым газом при 37 градусах Цельсия со скоростью 15 оборотов в минуту.
Меняйте культуральную среду каждые шесть дней. Через 14 дней собирают супернатанты и микроносители клеточной культуры для дальнейшего анализа. Центрифугируйте супернатант клеточной культуры в 300 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и соберите супернатант, выбрасывая клеточный мусор.
При четырех градусах Цельсия последовательно центрифугируйте супернатант в 2000 раз G в течение 10 минут, а затем в 10 000 раз G в течение 30 минут, чтобы выбросить более крупные везикулы и собрать гранулу. После повторного использования гранулы в 40 миллилитрах PBS центрифугируют клеточную суспензию в 120 000 раз G в течение 70 минут при четырех градусах Цельсия. Затем повторно суспендируют собранную гранулу, содержащую экзосомы, в 500 микролитрах PBS.
Разбавляют свежеизолированные образцы экзосом стерильным PBS до концентрации от 10 до седьмого-10-девятого частиц на миллилитр и вводят 500 микролитров образца для каждого пробега в анализ отслеживания наночастиц или систему NTA со скоростью 30 микролитров в минуту и от 24,4 до 24,5 градусов Цельсия. Вручную настройте систему захвата и анализа в соответствии с протоколом производителя. Визуализируйте частицы с помощью лазерного рассеяния света и захватите их броуновское движение на цифровом видео.
Затем проанализируйте записанные видеокассеты с помощью программного обеспечения, отслеживая не менее 200 отдельных частиц за прогон. Для вестерн-блоттинга добавьте 300 микролитров коктейля буфера лизиса и ингибиторов протеазы в экзосомы с смешиванием путем пипетирования вверх и вниз. Затем дайте ему постоять на льду в течение 20 минут.
После центрифугирования смеси в 9, 391 раз g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия измеряют концентрацию белка в супернатанте с помощью набора для анализа белка. После анализа нагрейте образец 100 микролитрами 4-кратного буфера загрузки белка при 100 градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем загрузите 15 микролитров белков в концентрации 10 миллиграммов на миллилитр, чтобы запустить гель-электрофорез при 120 вольтах в течение 70 минут и электро-блоттинг при 100 вольтах в течение 60 минут при четырех градусах Цельсия.
Обнаружение специфических маркеров, не связанных с экзосомами, таких как кальнексин, и экзосомальных биомаркеров, таких как CD9, CD63 и CD81, путем флуоресцентного вестерн-блоттинга. В исследовании проточная цитометрия использовалась для идентификации поверхностных маркеров SF-MSC. Анализ проточной цитометрии показал, что культивируемые SF-МСК были отрицательными для CD34, CD45 и HLA-DR и положительными для CD73, CD90 и CD105, соответствуя критериям идентификации МСК.
При инвертированной микроскопии было замечено, что SF-MSC размножаются на микроносителях. SF-MSC распространялся в 3D-культуре быстрее с шести дней по сравнению с 2D-культурой. Экзосомы из SF-MSC 2D и 3D культуры были идентифицированы с использованием западного блоттинга, и было обнаружено, что экзосомы экспрессируют CD63, CD9 и CD81, будучи отрицательными для кальнексина.
Анализ наноцитов показал, что диаметр 2D и 3D экзосом составляет примерно 120 нанометров. Просвечивающий электронный микроскопический анализ выявил морфологию 2D и 3D экзосом, показывая примерно сфероидальные везикулы. С помощью анализа NTA была проанализирована концентрация частиц размером от 30 до 160 нанометров.
После 3D-культуры концентрация частиц составляла 4,0 раза 10 до шести на миллилитр. Однако после 2D-культуры концентрация частиц одинакового размера составляла в 2,5 раза 10-шесть на миллилитр. Кроме того, 3D-культура производила больше экзосомного белка, чем 2D-культура.
Репрезентативный анализ показывает интернализацию меченых Dil экзосом первичными хондроцитами. Дил-меченые экзосомы, введенные первичными хондроцитами, можно увидеть с пиком в три часа. Исследование доставки in vitro показало, что экзосомы могут доставлять сульфоцианин3-меченую микроРНК-140 к хондроцитам.
Покрытие клеток, запуск реакции в биореакторе и супернатанта являются наиболее важными шагами в этом протоколе. 3D-культура обычно используется для крупномасштабной культуры адгезивных клеток. Другие методы, такие как spin flex, также могут быть использованы для крупномасштабного производства экзосом.
Наш метод улучшает выход экзосом, что позволяет применять экзосомы на основе MSC доклинического применения.
