Этот протокол будет полезен для исследователей, которые хотят разработать методы производства и очистки AAV с использованием системы культур клеток бакуловирус-насекомое. Производство AAV с использованием системы культивирования клеток бакуловируса-насекомого является экономически эффективным методом, который легко масштабируется и совместим с текущей надлежащей производственной практикой. Некоторые части протокола продемонстрирует Алан Хейзер, научный сотрудник моей лаборатории.
Начните с размораживания одного флакона клеток Sf9 и сразу же засевите их в 15 миллилитрах культуральной среды клеток насекомых. Выращивайте клетки Sf9 в орбитальном шейкерном инкубаторе при 125 об/мин и 28 градусах Цельсия в колбах с круглым дном со слабо прикрепленным колпачком для обмена воздухом. Размножайте клетки в однолитровой колбе, содержащей 200 миллилитров среды, чтобы получить достаточное количество клеток для производства клеток TIPS.
Добавьте 50 миллилитров ячеек Sf9 в 2 раза по 10 к 6-й силовой ячейке на миллилитр в двух колбах. Инфицировать одну колбу клеток Sf9 0,5 миллилитрами бакуловируса-AAV2-GFP, а другую колбу клеток 0,5 миллилитрами бакуловируса-AAV2-rep-cap. Три дня спустя соберите небольшую аликвоту инфицированных бакуловирусом клеток Sf9, также известных как клетки TIPS.
Окрашивание 2 раз по 10 до 5-й степени как неинфицированных, так и бакуловирус-инфицированных клеток Sf9 0,5 мкг мышиного антибакуловирусного gp64 антитела, содержащего флуоресцентный краситель в 100 микролитрах блокирующего буфера в течение 30 минут при температуре окружающей среды в темноте. После промывки клеток PBS для удаления антитела повторно приостановите окрашенные клетки в 300 микролитрах PBS, содержащих 0,5 бычьего сывороточного альбумина. Анализ экспрессии бакуловируса gp64 на клетках с помощью проточной цитометрии.
Когда клетки становятся жизнеспособными от 80 до 90%, с увеличением диаметра, собирают клетки и криоконсервируют 1 раз 10 до 7-й мощности клеток в одном миллилитре питательной среды насекомых, вытесненных 10% фетальной бычьей сывороткой и 10% диметилсульфоксидом в медленно замерзающем контейнере при отрицательных 80 градусах Цельсия. На следующий день переложите трубку, содержащую ячейки TIPS, в морозильную камеру с жидким азотом для длительного хранения. Культивируйте и выращивайте наивные клетки Sf9 в 2 раза по 10 до 6-й силовой ячейки на миллилитр при 28 градусах Цельсия в нескольких двухлитровых колбах, содержащих 400 миллилитров питательной среды клеток насекомых в шейкерном инкубаторе, который необходим для производства аденоассоциированного вируса или AAV.
Через три-четыре дня плотность клеток увеличивается до 5-6 раз до 10 до 6-й мощности ячеек на миллилитр. Для производства AAV в колбах в орбитальном шейкерном инкубаторе используйте пипетку или перистальтический насос для посева 400 миллилитров культуры Sf9 в 2 раза по 10 до 6-й мощности на миллилитр в двухлитровую колбу, асептически. Установите орбитальный шейкер при 125 об/мин и 28 градусах Цельсия.
Разморозьте по одному флакону каждого бакуловируса-AAV-GFP и бакуловируса-AAV-rep-cap TIPS клеток. Разбавьте клетки 20 миллилитрами питательной среды насекомых и проведите подсчет жизнеспособности клеток с помощью трипан-синего цвета. Инокулируют обе клетки TIPS в соотношении от 1 до 10 000 относительно наивных клеток Sf9, культивируемых в шейкерной колбе или биореакторе.
На второй день соберите один миллилитр культуры Sf9 асептически и окрашивайте синий краситель трипана, чтобы проанализировать количество клеток, жизнеспособность и морфологию. На третий день повторите шаги, выполненные на второй день, и проверьте состояние бакуловирусной инфекции после окрашивания клеток Sf9. На пятый день повторите шаги, выполненные на второй день, а затем соберите культуральную среду и клетки, когда жизнеспособность Sf9 снизится примерно до 50% Соберите супернатант и гранулу клеток после вращения и храните их при отрицательных 80 градусах Цельсия.
После того, как гранула ячейки AAV-продуцента разморожена, добавьте к ней буфер лизиса клеток и энергично перемешайте. Инкубируйте повторно суспендированную гранулу в течение 30 минут при температуре окружающей среды для высвобождения частиц AAV. После центрифугирования перенесите лизат клеток в новый контейнер.
Смешайте лизат клеток и супернатант клеточной культуры после размораживания. Добавьте 20 единиц на миллилитр нуклеазы и 10-миллимолярный хлорид магния в клеточный лизат для переваривания ДНК и РНК и инкубируйте в течение двух-четырех часов при 37 градусах Цельсия. Фильтруйте лизат через систему двойной фильтрации полиэфирсульфона 0,8 микрометра и 0,2 микрометра с помощью насоса.
Храните осветленный лизат клеток при четырех градусах Цельсия в течение ночи или немедленно очистите AAV. Установите 10-миллилитровый столбец AVB Sepharose на хроматографическую машину и вставьте трубопровод в образец AAV, буфер промывки и буфер элюирования. Вставьте трубки в пазы коллектора фракций хроматографической машины для сбора фракций столбчатого проходного раствора, буфера промывки и буфера элюирования, содержащего частицы AAV.
Уравновешивайте колонну AVB Sepharose с пятью колоннными объемами PBS со скоростью потока пять миллилитров в минуту. Загрузите фильтрованный лизат клеток, содержащий частицы AAV, в графу аффинности AVB Sepharose с помощью хроматографической машины, оснащенной насосом для образцов. Запустите образец со скоростью потока три миллилитра в минуту.
Запускайте PBS через колонну со скоростью потока три миллилитра в минуту, пока кривая поглощения ультрафиолета на 280 нанометрах не вернется к исходному уровню и не станет стабильной. Элюируют частицы AAV из колонны AVB Sepharose с помощью 50-миллимолярного буфера цитрата натрия pH 3 со скоростью потока три миллилитра в минуту. Немедленно разбавляют супернатант AAV одной пятой объема 500-миллимолярного Tris HCl pH 8.0 для нейтрализации буфера кислотного элюирования, содержащего AAV.
Это предотвращает pH-опосредованную деградацию, которая может произойти с кислым буфером элюирования pH 3.0. Затем разбавьте супернатант AAV в десять раз PBS, чтобы частицы AAV находились в физиологическом буфере. Храните один миллилитр каждой колонны проходимых образцов, промывочный буфер и 100 микролитров элюированного супернатанта AAV для оценки присутствия AAV путем инфицирования клеток-мишеней.
Настройте систему тангенциальной фильтрации потока, оснащенную мембранным картриджем с полиэфирсульфоновой мембраной со 100-килодальтонной отсечкой молекулярной массы для концентрирования AAV. Запустите 200 миллилитров PBS в течение 10 минут, чтобы уравновесить модуль фильтрации тангенциального потока. Загрузите образец AAV, контролируя расход насоса до тех пор, пока образец не уменьшится до желаемого объема.
Диафильтрат ретентат со 100 миллилитрами PBS. После концентрации образца AAV до нужного объема, соберите образец AAV, отфильтруйте его через 0,2-микрометровый полиэфирсульфонный фильтр и аликвотируйте его. Затем храните образец AAV при отрицательных 80 градусах Цельсия.
Большинство клеток Sf9 заразились бакуловирусом через три-четыре дня из-за множественных раундов инфекции, о чем свидетельствует экспрессия бакуловирусного гликопротеина gp64. Большинство клеток также показывают увеличение диаметра. Клетки показывают увеличение диаметра, цитопатический эффект, и около половины клеток умирают через пять дней после заражения, что является признаком завершения производства AAV.
Пик белка наблюдался при элюировании кислотным буфером, соответствующим фракции AAV. Очищенные образцы AAV показывают три различных капсидных белка: VP1, VP2 и VP3, после SDS-PAGE и серебряного окрашивания. Наиболее важным этапом является сбор клеток TIPS перед криоконсервацией, когда большинство клеток заражаются бакуловирусом, с минимальным количеством гибели клеток.
Здесь мы описали производство и очистку вектора AAV серотипа 2 в качестве модели. Тем не менее, протокол может быть применен и для других серотипов AAV.
