Этот протокол для производства вирусных векторов AAV является экономически эффективным и дает высокую чистоту, высокий титр, исследовательский класс AAV для использования в доклинических, крупных животных моделях. Этот метод использует адгезивные клетки HEK293 в камерах клеточной культуры, что экономит время и менее практично, что позволяет уменьшить количество сбоев в клетках. Этот протокол может значительно помочь в производстве вирусных векторов для области генной терапии, а также может быть использован для производства других серотипов AAV, которые также связывают сульфат гепарана.
Для начала соберите клетки HEK293 из культуры, когда она достигнет 80% конфлюентности. Аспирируйте среду перед аккуратной промывкой пластины культуры клеток тремя миллилитрами PBS. Затем аспирировать PBS и добавить три миллилитра трипсина.
Инкубируйте пластины в течение двух минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации нейтрализуют трипсин, добавив семь миллилитров полного DMEM в пластину, и собирают супернатант в конические трубки по 50 миллилитров. Осторожно переверните трубки, чтобы убедиться, что клетки однородны.
Чтобы определить плотность клеток, смешайте 10 микролитров образцов клеток с 10 микролитрами трипан-синего цвета. И добавьте смесь на слайд подсчета клеток для анализа в счетчике клеток. Смешайте клеточную суспензию с одним литром предварительно нагретого полного DMEM, чтобы увидеть культуральную камеру.
Осторожно поверните камеру, чтобы равномерно распределить ячейки. Инкубируйте камеру при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом. В дополнение к камере культивирования клеток, культивируемые клетки от 10 до четвертых клеток на сантиметр в квадрате в 15-сантиметровой пластине в качестве эталона для слияния.
После 65 часов инкубации, когда клетки на 80-90% сливаются, медленно добавляют смесь полиэтиленимин-ДНК и DMEM в порт камеры клеточной культуры. Распределите жидкость равномерно по всем рядам перед инкубацией при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 72 часов. После инкубации энергично встряхните камеру клеточной культуры, чтобы выбить клетки, пока среда не станет мутной, и разлейте ее в четыре или 500-миллилитровые центрифужные трубки.
Гранулируют клетки центрифугированием при 18 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Налейте осветленный супернатант в литровую бутылку PETG и повторно суспендируйте гранулы ячейки в 50 миллилитрах лицензированного буфера в 500-миллилитровых центрифужных трубках. Инкубировать пробирки в течение 60 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
После инкубации центрифугируют пробирки по 18 000 раз G в течение 30 минут и переносят супернатант в ту же литровую бутылку PETG. Хранить при минус 80 градусах Цельсия. Разморозьте сырой лизат при четырех градусах Цельсия за ночь.
После размораживания отфильтруйте его с помощью фильтра 0,22 микрона. Непосредственно перед этапами очистки пассивируют центробежный концентратор, добавляя четыре миллилитра буфера предварительной обработки фильтра для каждой используемой колонны гепарин-сефарозы. Поместите трубку в перистальтический насос.
Последовательно запускайте решения и носители. Подготовьтесь к хроматографии, присоединив пятимиллилитровую колонку гепарина-сефароза к трубке и пропустив 25 миллилитров Bazell DMEM через колонку. Затем загрузите 0,2 микромоляра отфильтрованного сырого лизата на колонну со скоростью потока от одной до двух капель в секунду.
Вымойте колонку последовательно, чтобы элюировать пять миллилитров пять раз с 300 миллимоларами хлорида натрия HBSS, с магнием и кальцием, и пометьте пять элюций как E1 до E5. Когда все будет готово, вращайте центробежный концентратор, содержащий буфер предварительной обработки, в 900 раз больше G в течение двух минут. Отбросьте сквозной поток. Промыть фильтр центробежного концентратора четырьмя миллилитрами HBSS магнием и кальцием, вращая в 1000 раз G в течение двух минут.
Затем добавьте элюирование E2 к центробежному концентратору и вращайте в 1000 раз G в течение пяти минут. Отбросьте сквозной поток. Аналогично вращайте элюирование E3 в центробежный концентратор до тех пор, пока концентрированный вирус не достигнет примерно одного миллилитра.
Удалите концентрированный вирус из центробежного концентратора с помощью фильтрованного наконечника P200 и соберите его в стерильную 1,5-миллилитрную центрифужную трубку. После сбора вируса промыть центробежный концентратор 200 микролитрами HBSS магнием и кальцием. Пипетка энергично поднимается и опускается в течение 30 секунд, чтобы выбить любой вирус, прилипший к мембране, и собрать концентрированный вирус в ту же 1,5-миллилитровую центрифужную трубку.
Хорошо перемешайте трубку. Вымойте колонну и насытите 20% этанолом перед хранением при четырех градусах Цельсия. Храните насосную трубку в одном молярном гидроксиде натрия.
Эффективность трансдукции капсида AAV6.2FF сравнивали у мышей, хомяков и ягнят в течение 28 дней после внутримышечного введения. Мышам вводили пять раз от 10 до 12-го векторного генома на килограмм AAV6.2FF человеческого IgG, экспрессируемого от 171 до 237 микрограммов на миллилитр человеческого IgG в сыворотке крови. Хомяку вводят два раза по 10 до 13-го вектора геномов на килограмм AAV6.2FF человеческого IgG, экспрессируемого гораздо более высоким уровнем человеческого IgG, чем у мышей.
В то время как модель крупного животного смогла выразить в среднем 35 микрограммов на миллилитр уровня IgG человека в плазме. Крупные животные модели могут определять экспрессию трансгена AAV in vivo и определять, оказывают ли трансгены терапевтический эффект против расстройства или заболевания, представляющего интерес. Исследование продемонстрировало отличную трансдукционную способность AAV6.2FF, нового вектора серотипа AAV 6 в скелетных мышцах, а также низкую иммуногенность вирусных векторов AAV in vivo.
